新疆棉田一種新棉鈴病害病原菌的鑒定

焦瑞蓮，任毓忠，李國英*，張莉*，張國麗

（1.石河子大學農學院/ 新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室，新疆石河子832003；2.新疆農墾科學院生物技術研究所，新疆石河子832000）

枝孢屬Cladosporium是絲孢綱異質性很強的屬之一。由于該屬真菌對環境具有較強的適應性，如耐滲透性、耐鹽性、耐熱性和嗜冷性等[1-2]，其分布廣泛，經常從土壤、食物、油漆、紡織品和其他基質中分離得到。它們也被認為是常見的內生真菌[3-4]，大多數腐生，有些為植物次生侵染真菌，可引起葉斑、葉霉、果腐、莖腐、紡織品腐敗及木材腐朽，使農產品遭受嚴重損失，少數枝孢菌還可引起人畜疾病。

枝孢菌種的形態特征易受到環境影響，不同種枝孢菌的形態特征常具有相似性，因此，一些常見種常被認為是復合種，如枝狀枝孢 （C.cladosporioides）、球孢枝孢（C.sphaerospermum）和多主枝孢（C.herbarum）等[5]，故國際真菌分類委員會認為枝孢菌是迫切需要進行分類鑒定的真菌。Braun 等于2003 年首次使用核糖體DNA 內轉錄間隔區（rDNA internal transcribed spacer，rDNA-ITS） 序列引物對枝孢屬進行了分子鑒定，結果表明，rDNA-ITS 引物可用于屬間鑒定，但對枝孢屬內種的鑒定效果不理想[6]。Schubert 等發現多位點DNA 序列分析方法，即基于rDNA-ITS、肌動蛋白 （Actin，ACT）、 翻譯延長因子 1-α（Translation elongation factor 1-α，TEF1-α） 序列分析可更好區分一些關系緊密的類群，這為枝孢菌分子生物學鑒定奠定了基礎[7]。隨后，Bensch 等于2012 年通過形態學特征并結合分子生物學的方法對枝孢屬進行了重新鑒定和分類，其中，有169 個枝孢菌確定了分類地位[1]。目前，在枝孢屬中已確認約200 個種[1,8-9]。

國內外關于棉花枝孢菌病害的報道很少，1929 年Jaczewski 將分離自棉花纖維上的枝孢菌命名為棉枝孢（C.gossypii）；Pidoplichko 和 Deniak 于1953 年將分離自烏茲別克斯坦棉花種子上的枝孢菌命名為棉生枝孢（C.gossypiicola），他們還于1959 年將分離自克里米亞棉花種子上的枝孢菌命名為棉生枝孢小型變種 （C.gossypiicolavar.minor），這是因其分生孢子較小[10-11]；此外，1967 年Gonen 將分離自以色列棉花種子上的枝孢菌定為C.tenuissimum，后被Bensch 鑒定為C.cladosporioides[1]。國內關于棉花枝孢病害報道更少，張中義等于1996―2003 年在中國陸續發布了有關新的枝孢菌，并將我國發生于棉花葉片上的枝孢菌鑒定為（C.gossypiicola）[10]。但目前國內外均未見有棉鈴枝孢菌病害的報道。

自2015 年開始，新疆棉田在結鈴后發生了一種新的棉鈴病害，即僵鈴與裂鈴病。2017 年該病在全疆大發生，重病棉田僵鈴和裂鈴率高達37%；2018 年該病雖發生較輕，但重病田發病率也達18.9%。為了明確該病發生的原因，為其防治提供依據，進行了本研究。

1 材料與方法

1.1 病害調查、病樣采集及癥狀描述

2017 年和 2018 年 8―9 月間，對北疆石河子植棉區及南疆阿克蘇植棉區的20 個植棉單位的棉花僵鈴與裂鈴病的發生情況開展調查，記錄病害的典型癥狀，同時采集典型癥狀（具有橄欖綠色霉層）的病樣38 份，共1 133 個病鈴，選出152個供分離鑒定。并對田間癥狀和接種后的癥狀進行觀察、描述和拍照。

1.2 病菌的分離、純化及代表性菌株的選擇

采用常規稀釋分離法[12]，對病原進行分離及單孢純化，然后根據采樣地點、棉花品種和菌落特征選取20 個代表菌株（南疆12 個，北疆8 個，具體見表1），4 ℃保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato dextrose agar medium，PDA）斜面試管上，供鑒定及后續研究。

1.3 菌種鑒定

1.3.1形態學鑒定。形態學鑒定主要參考Bensch等于 2012 年發表的 《The genusCladosporium》[1]和 Bensch 等于2015 年發表的 《Commen but different: The expanding realm ofCladosporium》[13]。將分離純化的20 個代表性菌株在PDA 培養基上培養14 d 后，觀察菌落顏色和形態，并鏡檢其分生孢子形態及顏色；用常規顯微計測的方法測量50 個孢子和孢子梗的大小。用玻片培養法，25 ℃下培養5 d，觀察分生孢子梗和分生孢子著生狀態，及分枝分生孢子、分生孢子和孢痕的形態。同時，用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM） 對枝孢菌獨特的孢痕結構、分生孢子梗和分生孢子表面紋飾進行觀察并拍照。

表1 菌株樣品編號及來源Table 1 Number and source of isolates

1.3.2分子生物學鑒定。將供試的20 個純化菌株在PDA 平板培養基上培養14 d 后，用刀片刮取菌絲體，用Bio Flux 試劑盒提取供試菌株的基因組DNA。將提取的DNA 置于－20 ℃冰箱中保存，備后續試驗。根據Braun 等[14]和Schubert等[7]多位點DNA 序列分析方法，分別用rDNAITS序列ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）、肌動蛋白編碼基因的部分序列 ACT-512F（5'-AT-GTGCAAGGCCGGTTTCGC-3'） 和ACT-783R（5'-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3'） 以及翻譯延長因子編碼基因的部分序列TEF1-728F（5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'）和 TEF1-986R（5'-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3'）為引物進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增產物分別用質量分數為1%（rDNAITS）和 2%（ACT、TEF1-α）的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行目的片段回收、載體連接和轉化，篩選陽性克隆，送至上海生物工程有限公司測序。測序結果用DNAMAN8.0 進行引物片段比對并截取，后在NCBI 上進行BlastN 比對，應用BioEdit軟件進行序列拼接，采用最大似然法利用Cipres網站（https://www.phylo.org/portal2/login）的 RAxML Blackbox 進行病原系統發育樹的構建，以甜菜尾孢菌Cercospora beticola（ITS、TEF1-α 和 ACT 登錄號分別是 AY840527、AY840494 和AY840458）作為外群，分析菌株間的親緣關系，確定病原分類地位。

1.4 致病性測定

分別采用3 個枝孢菌的代表性菌株C2 （代表C.cladosporioides）、C13（代表C.velox）和 C7（代表C.limoniforme） 的孢子懸浮液進行接種：即用血球計數板按常規方法配制孢子含量1×106mL－1的懸浮液裝入小型噴霧器內。然后在田間隨機選取健康、大小均勻的棉鈴，用體積分數75%酒精擦拭鈴面后再用無菌水沖洗，待鈴面稍干后，分有傷（針刺）和無傷噴霧接種，每種代表性菌株接種10 個棉鈴，并以不接種棉鈴作為對照，然后套袋保濕，并分別于接種后4 d、8 d、12 d和32 d 觀察并記錄其發病情況及癥狀。同時對發病鈴進行再分離，觀察再分離菌株與接種菌株的異同。

2 結果與分析

2.1 病害調查及癥狀描述

經2017 年和2018 年調查，該病最早在7 月上旬發生，7 月下旬至8 月上旬進入發病高峰，一般年份以棉株倒三果枝上棉鈴發生較重，但在發病較早和較重的年份病害發生提前，植株中下部棉鈴也會發病（如2017 年）并出現僵鈴和裂鈴。潮濕情況下鈴面病部出現橄欖綠色或黑綠色霉層。據調查發現，2017 年發病較重，北疆石河子重病棉田發病率平均為5.2%，南疆阿拉爾重病田發病率平均為8.0%，最重棉田發病率高達37%；2018 年發病較輕，北疆石河子重病棉田發病率平均為2.1%，南疆阿拉爾重病田發病率平均為3.6%，最重棉田發病率高達18.8%；2 年南疆棉田發病明顯重于北疆。可見，該病已成為新疆棉區一種常發性病害，應引起高度重視。

2.2 病原分離及代表性菌株的選擇

從南北疆20 個植棉單位共采集僵鈴與裂鈴病樣38 份，選出152 個典型病樣，從中成功分離出133 個枝孢屬菌株，選取其中20 個作為代表菌株，其中北疆 8 個（編號為 C1～C8）、南疆 12個（編號為：C9～C20）。其采樣地點、品種和時間見表1。

2.3 菌種鑒定

2.3.1形態學鑒定。分離菌株的主要形態特征：菌落呈天鵝絨狀、絮狀或絨毛狀，顏色多為橄欖綠色至黑褐色或灰橄欖色；菌絲有隔，光滑、稍粗糙；分生孢子梗單生，通常直立；分生孢子鏈狀，通常有大量分枝，多單胞；分枝分生孢子具有不止一個冠狀結構的孢痕；等等。根據上述形態特征，初步將其確定為枝孢屬（Cladosporium）。根據培養14 d 后20 個代表性菌株分生孢子梗、 分枝分生孢子和分生孢子大小、形狀、粗糙程度及表面紋飾等特征，初步將其分為3 類。

第一類包括：C1 ～C3、C5 ～C6、C8 ～C12、C15、C18 和 C20，共 13 個菌株，在 PDA 培養基上25 ℃黑暗培養14 d 菌落直徑達5.15～7.50 cm，初期菌落正面橄欖綠色，有皺褶并有些隱約輪紋；背面菌落暗綠色，并有裂紋，邊緣呈白色或無色。20 d 后菌落為灰橄欖色或土黃色，呈絮狀、毛氈狀或絨毛狀。菌絲光滑、有隔；分生孢子梗單生，光滑，有隔，直立或膝狀彎曲，大小（40.97～275.32）μm×（3.01～6.03）μm；分枝分生孢子亞圓柱形、圓柱形或近卵圓形，有1 個以上（多為2個或 3 個） 孢痕，大小 （4.82～33.24） μm×（2.43～5.76） μm，有隔 0～3 個； 分生孢子卵圓形、近紡錘形或近球形，大小（2.88～9.57）μm×（1.72～4.74）μm，有隔 0～1 個。分生孢子一般鏈狀著生或單生，每鏈最多有8 個分生孢子。在掃描電鏡下觀察，孢子表面略微光滑或有不規則的網紋。其形態特征與C.cladosporioides一致（圖1-A1～A6）。

第二類包括 C4、C13、C16 和 C17，共 4 個菌株，在PDA 培養基上25 ℃黑暗培養14 d 菌落直徑達4.35～4.75 cm，初期為深灰綠色，中心有絨毛狀灰白色氣生菌絲，邊緣有2～3 mm 的趨于黑色圓環，最邊緣呈白色或無色，正面菌落褶皺（由中心向外發射狀），背面培養基有裂縫，菌落生長較慢；20 d 后菌落暗灰色，絲絨狀、 絨毛狀或絮狀。菌絲表面光滑或有細疣，有隔；分生孢子梗表面光滑或有細疣，有隔，直或僅稍具膝曲狀，大小（66.40～338.12） μm×（3.01～4.90） μm；分枝分生孢子狹圓柱形或寬截形，有1～3 個孢痕，大小（6.56～32.09）μm×（1.83～4.74）μm，少有隔；分生孢子橢圓形、紡錘形、球狀、近球形至卵球形，大小（1.92～9.95）μm×（1.72～3.90）μm，無隔。分生孢子鏈狀著生或單生，每鏈最多有5 個分生孢子。在高倍掃描電鏡下可見孢子表面光滑或細疣狀。其形態特征與C.velox一致 （圖1-B1～B6）。

第三類包括 C7、C14 和 C19，共 3 個菌株，在PDA 培養基上25 ℃黑暗培養14 d 菌落直徑達4.00～4.45 cm，初期正面橄欖綠色，邊緣呈白色，有不規則褶皺，背面暗綠色，培養基開裂，菌落生長慢；20 d 后菌落顏色為土黃色，多絮狀。菌絲表面刺狀至微疣狀，有隔，通常不分枝；分生孢子梗稍光滑、不規則粗糙或微疣狀，有隔，不分枝，大小為 （43.64～268.46）μm×（2.51～6.48）μm ；分枝分生孢子錐形、狹圓柱形、橢圓形至梭形，有1～3 個孢痕，大小（7.61～33.28） μm×（2.76～6.02）μm，0～3 隔（隔膜處或稍有溢縮）；分生孢子檸檬形、 橢圓形、 倒卵圓形或紡錘形，大小 （2.61～14.40）μm×（1.93～4.82）μm，無隔。分生孢子鏈狀或單生，每鏈最多有8 個分生孢子。在高倍掃描電鏡下觀察，孢子表面疣狀或不規則刺狀。其形態特征與C.limoniforme一致（圖1-C1～C6）。

2.3.2分子生物學鑒定。采用真菌通用引物ITS1/ITS4 對病原基因組DNA 進行擴增，第一類菌株 （C1～C3、C5～C6、C8～C12、C15、C18 和C20）的產物為 551 bp，第二類菌株（C4、C13、C16和 C17）的為 553 bp，第三類菌株（C7、C14 和C19）的為 552 bp。在 NCBI 中 BlastN 上比對結果顯示：C1、C6、C10 和 C11 分別與C.cladosporioides、C.angustisporum和C.westerdijkieae（登錄號分別為 MK422159、MF422160 和 MF473314）的同源性均達到 100%，C2、C3、C5、C8、C9、C12、C15、C18 和 C20 分 別 與C.anthropophilum、C.cladosporioides和C.tenuissimum（登錄號分別為MF472933、AY213641 和 AJ300331）的同源性均為 100%；第二類菌株（C4、C13、C16 和 C17）與C.velox和C.domesticum（登錄號為 MF473310和MF472966）的同源性分別為100%和97.12%；C7、C14 和 C19 與C.cladosporioides、C.limoniforme、C.tenellum（登錄號分別為 MH329777、MF473139 和 KX674650） 的 同 源 性 均 達 到100%。

采用肌動蛋白（ACT）引物ACT-512F/ACT-783R 對代表菌株進行PCR，第一類菌株產物片段為231 bp，第二類菌株的產物為237 bp，第三類菌株產物為230 bp。在NCBI 中BlastN 上比對結果顯示：第一類菌株與C.cladosporioides（登錄號分別為HM148527、MH047330）的同源性分別是99.57%和100%，與C.anthropophilum（登錄號是MF574175）的同源性在96.51%以上；第二類菌株與C.velox（登錄號為MF474158）的同源性為99.15%，與C.michoacanense（登錄號為 LT907960）的同源性是90.76%； 第三類菌株與C.limoniforme（登錄號為：KS239999）的同源性在99.13%以上，與C.allicinum（登錄號為MF473754）的同源性在98.70%以上。

圖1 菌株形態Fig.1 Morphological characteristics of isolates

采用翻譯延長因子引物TEF1-728F/TEF1-986R 對代表菌株進行 PCR，發現 C1、C6 和 C8產物片段為 243 bp，C10 的 為 244 bp，C2、C3、C5、C9、C12、C15、C18 和 C20 產物片段長度為245 bp，C11 產物片段長度是 246 bp，C4、C13、C16 和 C17 的產物片段為 268 bp，C7、C14 和C19 產物片段為 238 bp。在 NCBI 中 BlastN 比對結果表明：第一類菌株與C.cladosporioides（登錄號 分 別 為 HM148258、HM148289、HM148260 和HM148266）的同源性為97.56%～100%；第二類菌株與C.velox（登錄號分別為 KT600556 和KJ596597）的同源性分別為97.28%和99.59%，第三類菌株與C.limoniforme（登錄號為KX240011）的同源性在94.56%以上。

對供試菌株進行多基因系統發育樹結果分析，第一類菌株 C1、C6、C8、C10、C11 與 C2、C3、C5、C9、C12、C15、C18、C20 分別在 2 個分枝上，但均與C.cladosporioides聚在一起；第二類菌株（C4、C13、C16 和 C17） 與C.velox聚在一起，形成一個明顯的分支； 第三類菌株 （C7、C14 和C19）與C.limoniforme聚在一起；外群甜菜尾孢菌Cercospora beticola與枝孢屬真菌位于明顯不同的另一分枝上（圖2）。根據上述病原的形態特征及多基因聯合系統發育分析，確定分離到的菌株為枝孢菌（Cladosporium），有 3 種，分別是C.cladosporioides、C.velox以及C.limoniforme，其中C.cladosporioides占供試菌株的65%，為優勢種。

2.4 致病性測定

圖2 基于rDNA-ITS / TEF1-α/ACT 聯合序列的供試菌株與相似種的系統發育樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the tested strains with similar species based on combined rDNA-ITS/TEF1-α/ACT sequence

圖3 僵鈴與裂鈴田間與接種癥狀Fig.3 Symptoms of stiffness and cracking boll in field and inoculation

C2、C13、C7 這 3 種代表性菌株進行人工接種，在有傷接種的情況下，第4 天在棉鈴上出現紫紅色或褐色小點，之后小點逐漸擴大，若氣候干燥則病斑擴展很慢，若氣候潮濕則病斑擴展較快，嚴重時病斑互相融合連接成片（圖3-5），最后棉鈴的病斑處壞死、干枯，導致棉鈴不能正常吐絮，形成僵鈴或裂鈴；潮濕情況下病斑處產生橄欖綠色或黑綠色霉層（圖3-6），與田間癥狀（圖3-1～3）相似。無傷接種發病較晚，病斑擴展也較慢（圖3-4），對照都不發病（圖3-7）。從病斑處再分離，可分離出接種菌株。

3 討論與結論

自2015 年以來在新疆棉田發生了一種新的棉鈴病害，即棉鈴被感染后常形成僵鈴和裂鈴；潮濕情況下則在病部表面產生一種橄欖綠色或黑綠色的霉層。現該病已成為新疆棉田一種常見的病害。由于它的發病率基本等于其造成的減產率，所以必須高度重視。該病害和以往的棉花爛鈴病明顯不同，并不局限在棉株中下部棉鈴發生，有時在上部棉鈴發生也重。根據柯赫氏法則，對該病的病原進行分離鑒定，確定為枝孢菌（Cladosporium）。

由于枝孢菌有些種彼此之間在形態上具有相似性，同時其分生孢子的大小、形狀、分隔、著色、表面紋飾等形態特征易受環境條件的影響，具有高度可變性，所以僅根據形態學進行枝孢菌種的鑒定存在一定的困難，必須結合分子生物學鑒定。本研究使用rDNA-ITS、肌動蛋白（ACT）和翻譯延長因子1-α（TEF1-α）的編碼基因序列對供試菌株進行了分析，發現rDNA-ITS 鑒別性較低，這與Lee 等[15]研究結論相一致；ACT 和TEF1-α 區分枝孢菌不同復合種（Complex）的效果大致相同，但TEF1-α區分復合種內不同菌種的效果要比ACT 精確。所以，在枝孢菌分子生物學水平上，通過分析ACT 和TEF1-α 的編碼基因序列可更好地對枝孢菌的種進行鑒別。這與Bensch 等[1]的研究結論相一致。

以形態學鑒定為基礎，經致病性測定，結合rDNA-ITS、肌動蛋白（ACT）和翻譯延長因子 1-α（TEF1-α）的編碼基因序列分析，確定引起新疆棉田僵鈴與裂鈴病的枝孢菌共有3 種： 即C.cladosporioides、C.velox和C.limoniforme，其中C.cladosporioides是其優勢種。由枝孢菌所引起的鈴病在我國屬首次發現。

致謝：

感謝石春發先生（貴州黔東南州林業科學研究所）在系統發育樹制作上的技術指導。