GhACT1啟動子驅動Lc基因在棉花幼胚纖維中特異表達

范小平，范博紅，馬冬菊，衛武宵

（山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

彩色棉因擁有天然彩色纖維的環保優勢一直以來受到廣大消費者的喜愛，因而多年來彩色棉選育是棉花研究領域的熱點之一。目前運用生物學技術進行棉花遺傳分析[1]以及彩棉纖維發育規律[2]等研究的報道層出不窮，而利用轉基因把色素基因導入棉花也是棉花纖維顏色改良研究的重要手段之一。最早的色素基因研究是對玉米色素合成通路基因的遺傳分析[3]，在此基礎上，經過20 多年的探索與研究，陸續從玉米中發現了花青素合成所必需的2 組基因：一組是編碼參與花青素合成及生化反應酶的結構基因，另一組編碼調控色素沉積時空分布的蛋白。這些基因的編碼產物分別屬于MYB 類的C1 家族和MYC 類的R 家族[4]。Lc基因則屬于花青素合成必需的MYC 類的R 家族基因，編碼1 個基本的螺旋-環-螺旋轉錄活性因子，在花青素生物合成通路中起作用，具有調控植物體中花青素的時空分布功能[5]。近年來，Lc基因被成功導入多種植物中，并且成功整合與表達，例如矮牽牛[6-7]、煙草[8]、番茄[9-10]、蘋果[11]等。在棉花中，2016 年 Fan 等[12]將35S 驅動的Lc基因轉入棉花，轉基因棉花的莖、葉等營養器官、花及纖維中均呈現紅色；然而由于營養體、 生殖體中花青素的過量合成與積累，嚴重影響了轉基因棉花再生苗的生長與發育，最終僅獲得2 個可育株系。GhACT1 是2005 年Li等[13]通過篩選cDNA 文庫得到的15 個肌動蛋白cDNA 序列中，在棉花纖維中特異表達最強的1個序列。因此，本研究以纖維特異表達的GhACT1 啟動子替換35S，構建植物表達載體GhACT1-Lc-pBI121 轉化棉花，減少不利于轉基因棉苗正常生長發育的因素，為纖維中花青素合成機理研究及彩色纖維育種研究提供品系資源。

1 材料與方法

1.1 載體構建

將PBI121 中的GUS 酶切替換為Lc基因；將35S 啟動子經酶切替換為GhACT1 啟動子，構建 GhACT1-Lc-pBI121 載體（GhACT1-Lc）。

1.2 植物材料

珂字棉312（C312）無菌苗的下胚軸作為外植體，無菌苗的處理與操作方法同參考文獻[10]所敘。

1.3 農桿菌的轉化

將構建好的載體通過熱激法轉化農桿菌AGL1。隨機選擇3 個獨立的單菌落作為模板，以非轉化的菌落為陰性對照，以質粒作為陽性對照，進行nptⅡ、Lc和GhACT1 的聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）檢測，驗證載體構建及轉化成功與否。經PCR 擴增檢測單菌落為陽性的克隆，接入含有利福平和羧芐青霉素的 LB 液體培養基中，在 28 ℃、250 r·min－1的搖床上過夜，OD600為0.8 左右，即可保留菌種或用于轉化棉花。

1.4 轉化植物

將培養的菌液離心，倒掉上清液，重懸于Murashige&Skoog（MS）培養基中[14]，加入乙酰丁香酮 （Acetosyringone，AS）。浸染無菌苗下胚軸10 min。然后將其放入無篩選劑的MS 培養基，共培養2 d 后，在篩選培養基中培養2～3 個月，每月繼代1 次。挑取篩選到的陽性愈傷進行組織培養，通過誘導胚胎發生，獲得再生棉苗方法同參考文獻[12]所述。所獲得的轉基因再生棉幼苗在三角瓶中長至5～7 葉，根系健壯時，經過溫室煉苗，移栽至營養土中，緩苗后移到網室，即在正常的日光條件下生長。

1.5 轉基因再生苗的DNA提取及PCR檢測

在試管苗移栽前，采集棉花再生苗的1 片嫩葉粗提DNA，以Lc片段設計引物進行PCR 檢測。

Lc引物：Lc-L：5'-GGGGGATCCATGGCGCTTTCAGCTTCCCCGAG-3'，Lc-R：5'-GGGGATATCACCGCTTCCCTATAGCTTTGC-3'。片段長度為 1.4 kbp。擴增程序為 94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35 個循環，72 ℃ 10 mim，然后4 ℃保存。

GhACT1 引物：GhACT1-L：5'-GGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3'，GhACT1-R：5'-CTTTTACAATACTGAAAATAAGAT-3'。片段長度為 0.8 kbp。PCR 擴增程序為 94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，58℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環，72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。

1.6 轉基因再生苗的Southern blot雜交

移栽后的棉株長到5 片展開葉時，摘取頂端2 片葉，采用 CTAB 法提取棉花總 DNA[15]，進行分子生物學檢測Southern blot 雜交。吸取10 μg DNA，經 20 個酶活力單位（U，active unit）的限制性內切酶BamHⅠ37 ℃過夜酶切后，于10 g·L－1的瓊脂糖凝膠中電泳過夜，分離酶切后的DNA片段，在堿性條件下通過毛細管吸附作用將片段DNA 轉移到尼龍膜上用于雜交。根據產品說明制作地高辛標記的Lc探針，然后在42 ℃雜交箱中雜交過夜。雜交后的雜交膜在檸檬酸鈉（Saline sodium citrate，SSC） 與十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）的混合緩沖液中沖洗，最后按照地高辛發光檢測試劑盒（ROCHE 公司）的說明，加入標記抗地高辛抗體（Anti-digoxigenin AP-conjungate，AP）使抗體與地高辛結合，清洗后加入顯色液顯色。

1.7 RNA的抽提與表達量檢測

采用改良的熱酚法抽提不同發育階段纖維的RNA，方法同Li 等[13]所述。首先在熱酚中加入等體積的酚- 氯仿，置于65 ℃的水浴鍋里溫浴15 min；再取棉花幼胚置于液氮中研磨至粉末，并及時將其轉入提取緩沖液中，劇烈震蕩混勻；然后在 4 ℃離心機上 12 000 r·min－1離心 20 min，吸取上清，再加入等體積酚- 氯仿重復處理數次，最終用 4 mol·L－1氯化鋰沉淀，溶于無菌的焦碳酸二乙酯 （Diethy-pyrocarbonate，DEPC）水中備用。表達量檢測采用逆轉錄 （Reverse transcription，RT）PCR 檢測法，同 2016 年 Fan 等[12]的報道。

1.8 未成熟胚的離體培養

取開花后2 d 的幼鈴，在體積分數為70%的酒精溶液中浸泡1 min 后，在超凈工作臺上切開，挑出已經長出短絨凸起的幼胚放入改良的液體培養基[16]。其中每一幼鈴中的幼胚對半分為2 個部分，一部分進行正常的光照培養（光周期為16 h/8 h，光照強度為3 000 lx）；另一部分完全暗培養；剝取10 個轉基因棉花株系的幼胚重復3 次，同時取未轉化的C312 棉鈴未成熟胚作為對照，同樣分2 個部分分別培養。具體方法同2016 年Fan 等[12]的報道。

2 結果與分析

2.1 載體轉化農桿菌單菌落的PCR驗證結果

從圖1 的PCR 檢測結果發現，篩選獲得的質粒與單菌落都攜帶有標記基因nptⅡ、 目的基因Lc和GhACT1 啟動子，而非轉化菌落N 未出現條帶（圖1），說明植物表達載體構建正確并成功轉化農桿菌，這些單菌落將繼續用于外植體轉化及此后的試驗工作。

圖1 質粒及單菌落PCR 驗證結果Fig.1 PCR test result of single colony and plasmid

2.2 轉基因再生株系的PCR檢測結果

經過體細胞胚胎發生獲得轉基因棉花再生苗 （圖2）。移栽前，對瓶中36 株再生株系進行PCR 檢測，結果有25 個株系為PCR 陽性，其中部分轉Lc基因的棉花株系PCR 檢測結果見圖3。

2.3 Southern blot雜交檢測結果

Southern blot 雜交檢測結果確認25 個轉基因棉花株系均為陽性。圖4 顯示了其中10 個株系的Southern blot 雜交結果，10 個泳道均出現明顯雜交條帶。其中：株系 La89、La83 和 La105 為多拷貝插入； 其余7 個株系均顯示為1 條雜交帶，這7 個株系是否為單拷貝遺傳，還要對其T1植株基因分離情況進行統計分析才能確定。通過觀察發現，這些再生苗在成長過程中沒有明顯顏色變化，植株的生長發育及后代育性也基本正常。

2.4 轉基因株系中Lc基因的表達檢測（RTPCR）結果

在GhACT1-Lc 轉基因再生株系的生長過程中，莖葉以及花果均沒有明顯的顏色變化。RT-PCR 檢測結果發現，在轉基因棉花株系的營養組織如葉、 葉柄和莖中均沒有看到Lc基因的表達信號，如圖5。

圖2 轉基因棉花再生苗Fig.2 Transgenic regenerants of cotton

圖3 部分轉基因棉花再生株系的PCR 檢測結果Fig.3 PCR test results of part of transgenic lines

RT-PCR 檢測結果發現，轉基因棉花幼胚及新生纖維，即棉花纖維發育初期如起始期及伸長期早期有較明顯轉錄水平的表達（圖6），并且表達水平基本一致，而在幼胚發育12 d 時表達信號明顯減弱，而在后來的伸長期及增厚期沒有出現表達信號（圖片未顯示）。

圖4 10 個轉基因棉花株系的Southern 雜交結果Fig.4 The test result of southern blot of 10 transgenic lines

圖5 轉基因株系營養體中Lc 基因表達的檢測結果（RT-PCR）Fig.5 Test of Lc expression in vegetative tissues of transgenic cotton plants by RT-PCR

圖6 轉基因株系不同生長期（開花后1、2、3、5、7、9、12 d）幼胚和纖維中Lc 基因的表達情況Fig.6 The Lc gene expression levels in ovules and fibers at the indicated stages (at 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12 days post anthesis)

2.5 幼胚離體培養試驗結果

根據Fan 等[12]的報道，在35S-Lc 轉基因株系中，需要光照條件下才可以看到纖維顏色的變化，因此進行了棉花幼胚的離體培養試驗。結果表明，同35S-Lc 轉基因棉花一樣[12]，在光照條件下培養1 周后10 個GhACT1-Lc 轉基因株系的幼胚表皮毛均呈現紅色，3 次重復表型一致；而另外一組在完全黑暗培養條件下，GhACT1-Lc 轉基因株系幼胚的表皮與纖維都保持全白色 （圖7）。在同樣培養條件下，2 組非轉基因棉花幼胚均未出現紅色纖維。在10 倍顯微鏡下觀察紅色纖維發現，與35S-Lc 轉基因再生株一樣花青素紅色油狀物積累在幼嫩纖維細胞的中央大液泡中[12]。GhACT1-Lc 轉基因株系后代 T1、T2的幼胚離體光照培養試驗結果顯示，幼胚纖維同樣出現紅色，說明整合在這些轉基因株系中的Lc基因是可遺傳并持續表達的。

圖7 轉基因株系幼胚在離體培養條件下光照和暗培養的對照試驗結果Fig.7 Comparison of test results of transgenic immature ovules cultured under light or in dark for 1 week

3 討論

本研究轉基因過程中，通過卡那霉素篩選獲得36 個轉基因棉花再生株系，以Lc為引物經PCR、Southern blot 檢測有 25 個陽性轉基因株系，其他11 個株系通過了卡那霉素的篩選卻不含有Lc基因。因而推測，在外源目的基因整合棉花時，產生報告基因nptⅡ整合入棉花體內，而目的基因Lc缺失的現象。這一現象在以往的轉基因試驗中也時有發生，這可能是轉基因過程中常常產生假陽性的原因。而這一現象的分子生物學原理及理論解釋，還有待深入研究。

據文獻[12]報道，35S-Lc 轉基因棉花再生株系中最終僅獲得2 個可遺傳后代，原因是過量的花青素在棉花植株的營養體與生殖體細胞中合成與積累，具有毒害細胞作用，導致細胞停滯生長發育，嚴重時甚至導致細胞死亡[17-18]。在35S-Lc轉基因過程中，組織培養時棉花愈傷組織呈現紅色甚至紫色，會影響愈傷細胞的繁殖與分化；體細胞胚呈現紅色或紫色，會影響胚的正常萌發，導致僅有少數胚可以長成試管苗。此外，試管再生苗的幼葉、莖稈及幼根呈現紅色，使得再生苗移栽成活率較低；再生苗的花藥、柱頭變紅色，花粉量少，明顯影響了轉基因棉花再生苗的獲得。而GhACT1-Lc 的轉基因棉花試驗結果表明，轉基因棉花再生株系在整個轉基因過程中均沒有出現明顯的顏色變化，最終獲得較多轉基因棉花再生株系。另外，GhACT1-Lc 的轉基因棉花再生苗的生長發育與外源基因導入的拷貝數也沒有明顯關系。無論是單拷貝或多拷貝插入，都沒有顏色變化，沒有影響到棉花的正常生長與發育。結果證明，用特異表達的GhACT1 啟動子替換組成型35S 啟動子轉化Lc基因，是獲得彩色棉材料的有效途徑。

RT-PCR 表達檢測結果表明，Lc基因僅在轉基因棉花幼胚纖維中表達，在營養體各器官組織中沒有表達，這與轉基因棉花的外在顏色變化相一致。從而可以推測Lc基因的存在，決定了轉基因株系的顏色變化。由于棉花種皮中沒有色素腺體[19]，在自然生長情況下，由種皮細胞伸長形成的纖維沒有顏色的變化。而Lc基因在轉基因株系幼胚纖維中有較強的表達，在光照條件下可催化花青素合成出現紅色纖維。本研究中光照與黑暗對比試驗結果驗證了這一觀點。幼胚的光照與黑暗離體培養試驗結果表明，在轉基因棉花幼胚表皮毛的初始及伸長期早期，纖維細胞中出現紅色液體，經顯微鏡觀察，同35S-Lc 轉基因棉花纖維一樣，花青素紅色油狀物積累在幼嫩纖維細胞的中央大液泡中。這是因為色素在細胞質中合成后，經ATP 連接的H+泵作用，被壓入液泡中[20]。在試驗過程中發現，變紅的棉纖維繼續培養1 周后，新伸長纖維不再繼續變紅，而是變為粉色甚至褪色為白色。這一現象表明在后來的生長過程中，纖維沒有產生新的花青素，而已經產生的花青素也因為條件的變化而褪色，推測是由于GhACT1 啟動子在棉纖維伸長期及次生壁增厚期不再具有功能，不能夠驅動目的基因Lc表達而調控花青素的合成與積累。這一現象驗證了2008 年范小平等的GhACT1 反義功能研究結果，即GhACT1 僅在棉花纖維發育初始階段表達，在伸長期及次生壁增厚期表達微弱甚至沒有[21]。而 2005 年，Li 等的報道也說明GhACT1 在幼胚纖維伸長期開花后10 d 之前有較強表達，而在營養體組織如葉、 根等及生殖體組織如花藥、花瓣、苞片里沒有或僅有很弱的表達，在纖維成熟期幾乎沒有表達[13]。因而這也是今后改良棉花纖維顏色研究需要改進的地方。

4 結論

通過農桿菌介導法將GhACT1-Lc 轉入棉花，獲得25 個轉基因棉花再生株系。通過試驗證明GhACT1-Lc 成功整合到棉花基因組，并且在幼胚纖維中具有一定的功能，促進了花青素在棉花纖維中的合成積累，使轉基因棉花幼胚纖維在離體光照條件下呈現紅色，為今后改良棉花纖維顏色研究奠定了基礎。