陸地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

杜靜靜，田岳，馮昊，郭夢蘭，楊琴莉，丁林云，李潔，胡艷,*，張天真,

（1.南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京210095；2.浙江大學農業與生物技術學院農學系，杭州310058）

自然界中植物通過基因的激活、沉默以及時空特異性的表達來調控細胞的分化、組織器官的形成以及植株的生長發育過程，這一系列的調控過程需要各種各樣的酶和調節蛋白共同協作完成。轉錄因子（Transcription factor，TFs）就是這樣1 類調節蛋白。MYB 轉錄因子是目前在植物體內發現的數量最多、 種類最豐富的1 類轉錄因子，因其N 端高度保守的DNA 結合域——MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）結構域而得名，該結構域由1 個或數個51～52 個氨基酸串聯而成的R 結構域組成[1-3]。R 結構域的主要作用是參與空間結構中疏水核心的形成，其數量是區分不同種類MYB 基因的主要依據[4]。根據 R 結構域的數量，MYB 基因家族分為 4 大類：（1） 含有 1 個 R 結構域的為1R-MYB；（2）含 2 個 R 結構域的為 R2R3-MYB；（3）含有 3 個 R 結構域的為 3R-MYB；（4）含有 4個R 結構域的MYB 類轉錄因子，稱為4R-MYB類轉錄因子[5]。研究表明，MYB 轉錄因子在植物的次生壁（Secondary cell wall，SCW）發育過程中發揮重要的作用[6]。高等植物尤其是擬南芥次生壁的加厚過程受到基于NAC-MYB 轉錄因子形成的三級調控網絡的調控：NAC 類轉錄因子作為轉錄開關調控位于下游的第二級MYB 類轉錄因子，從而影響第三級的主要以MYB 轉錄因子為主的轉錄因子，進而調控纖維素、半纖維素等的合成[7]。

棉花成熟纖維細胞壁含有90%以上的纖維素[8]。在棉花纖維細胞壁次生壁加厚期開花后16～40 d（Days post anthesis，DPA），纖維素大量合成和沉積[9]。目前，有關纖維素合成和代謝的主要調控因子纖維素合酶的研究已有不少報道[10]，其他糖代謝基因如蔗糖合酶、 幾丁質酶、β-1, 3-內葡聚糖酶等也與纖維次生壁加厚密切相關[11-15]。除此之外，一些轉錄因子也參與棉花纖維細胞次生壁加厚過程。棉纖維細胞次生壁加厚期優勢表達的NAC 類轉錄因子 GhFSN1 在纖維SCW 加厚期起正向調控作用。轉基因試驗證明，在棉花中過表達GhFSN1 基因能夠促進棉纖維SCW 厚度的增加，但纖維長度變短。轉錄組數據表明GhFSN1 能夠通過激活其下游SCW 相關基因來促進棉纖維SCW 的生長發育，其中MYB 在調控網絡中發揮重要的作用。但是，GhFSN1 基因是通過調控哪些MYB基因參與棉纖維次生壁的發育過程尚不清楚[16]。

次生壁加厚期纖維素的合成影響纖維的強度與馬克隆值等，該時期是決定棉纖維品質的關鍵時期。因此，挖掘參與棉纖維次生壁加厚期的基因，研究次生壁發育的分子機制和調控網絡具有重要的意義。本研究從陸地棉中篩選到1 個在棉花纖維次生壁加厚期優勢表達的MYB 轉錄因子基因GhMYB52，對其進行組織表達、轉錄激活鑒定、亞細胞定位和酵母互作分析，初步探究該基因的表達模式和分子功能，為今后深入研究該基因的分子生物學特性及遺傳進化等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

用于棉花組織表達分析的陸地棉（Gossypium hirsutumL.） 材料 TM-1 和海島棉 （G.barbadenseL.） 材料海7124 均種植于南京農業大學當涂試驗基地（安徽省馬鞍山市當涂縣），采用常規大田管理。

用于瞬時轉化的煙草材料為本氏煙，種植于浙江大學人工氣候室，溫室條件：溫度22 ℃；光照16 h、黑暗8 h；相對濕度75%～80%。

以上所用植物材料均由南京農業大學作物遺傳與種質創新國家實驗室提供。

1.2 載體與試劑

使用的轉基因載體 pBINGFP4、pGBKT7、pGADT7 載體以及Y2H 菌株保存于本實驗室。大腸桿菌DH5α 感受態購于Vazyme 公司、 農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 GV3101 感受態購于南京沃華生物科技有限公司。限制性內切酶BamHⅠ、SmaⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、NcoⅠ購于NEB 公司。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自 Axygene 公司。One Step Cloning Kit 重組酶、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶、HiScript Reverse Transcriptase 反轉錄試劑盒購買自 Vazyme 公司。YPDA、SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His 營養缺陷培養基、酵母雙雜試劑盒（Cat.No.630489）購于 Takara 公司（中國，大連），X-Glu 試劑購于南京梅林雪海公司。乙酰丁香酮購于源葉生物。引物合成和測序由杭州擎科生物有限公司完成。RNA 快速提取試劑盒購于鐘鼎生物（中國，南京）。本研究所用引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

按照EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒說明書，提取TM-1 和海7124 的花托、花瓣、雄蕊、 雌蕊、 花萼、－3 DPA、－1 DPA、1 DPA、3 DPA 的胚珠，以及 5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA、30 DPA 的棉花胚珠和纖維組織RNA。使用反轉錄試劑盒將各組織RNA 反轉錄，合成第一鏈cDNA。

1.4 GhMYB52基因的克隆

根據本課題組對MYB 轉錄因子家族分析結果，從陸地棉 TM-1 基因組（V1.1）中獲得了 34 個位于A12 號染色體上的R2R3 類MYB 轉錄因子基因。結合陸地棉TM-1 的35 個不同組織表達譜數據[10]，從中選出了1 個在棉花纖維發育次生壁加厚期優勢表達的基因Gh_A12G2460。因其與擬南芥中AtMYB52 基因的相似度最高，將其命名為GhMYB52。進一步通過一步克隆法，設計帶有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點的重組引物（Gh-MYB52F 和 GhMYB52R），以 TM-1 20 DPA 纖維組織的cDNA 為模板擴增目的基因。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）產物經過凝膠電泳膠回收試劑盒純化后，與使用相同酶切位點進行雙酶切后的pBinGFP4 載體進行重組連接，并轉化大腸桿菌。利用pBinGFP4 載體通用引物GFP4F 和GFP4R 進行陽性鑒定，并送至杭州擎科生物有限公司進行測序。

1.5 生物信息學分析

使用 DNAMAN 軟件對 GhMYB52 氨基酸序列進行保守性分析。采用鄰近連接法（Neighbor-joining,NJ） 使用 MEGA 構建系統進化樹[17]。通過 ExPASy（https://www.expasy.org/）在線網站預測GhMYB52 蛋白序列的理化性質和蛋白結構模型。

1.6 實時定量PCR

實時熒光定量 PCR （Real-time quantitative PCR，RT-PCR）反應體系和反應程序按照AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 試劑盒說明書進行。定量 PCR 儀型號為 Roche LightCycler 96 實時熒光定量PCR，操作方法參考分析儀說明書。定量引物為 GhMYB52-qF 和 GhMYB52-qR。棉花組成型表達的Histone3 基因（Gh_D03G0370）為內參基因?；虻南鄬Ρ磉_量采用2－ΔΔCt方法分析，試驗進行3 次技術重復。熒光定量的數據利用Excel 軟件，通過最小顯著差數法（Least significant difference，LSD）進行差異顯著性分析。

1.7 酵母轉化

設計帶有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點的PCR引物：GhMYB52-YF 和 GhMYB52-YR，GhFSN1-YF 和 GhFSN1-YR，分別擴增GhMYB52 和GhFSN1 基因的編碼序列（ Coding sequence，CDS）。按照一步克隆法，構建 GhMYB52-pGBKT7 和GhFSN1-pGADT7 載體。按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2 試劑盒說明書操作方法，將 GhMYB52-pGBKT7 質粒轉化 Y2H 菌株，涂布于含有 50 μg·L－1AbA（Aureobasidin A，金擔子素）抑制劑的SD/-Trp 營養缺陷型培養基上，以進行轉錄激活/ 抑制功能的驗證。另外，將Gh-MYB52-pGBKT7 和 GhFSN1-pGADT7 質粒共轉化 Y2H 菌株，并設置陽性對照 （pGBKT7-53＋pGADT7-T）、 陰 性 對 照 （pGBK-Lamin c ＋pGADT7-T），涂布于含有 450 μg·L－1AbA 抑制劑的三缺SD/-Trp/-Leu/-His 營養缺陷型培養基上，進行酵母互作分析。將培養基置于30 ℃恒溫培養箱，培養2 d 左右，觀察菌斑的生長情況。

1.8 亞細胞定位鑒定

采用農桿菌轉化法，將構建好的過表達載體35S::GhMYB52::GFP 轉化農桿菌菌株 GV3101。按照煙草瞬時轉化法，選取培養25 d 的煙草，將準備好的農桿菌菌液，注射進完整且厚的煙草葉片中。注射后對侵染的煙草葉片進行避光處理，48 h 后在Zeiss 熒光共聚焦顯微鏡下觀察注射過的煙草葉片中的GFP 信號[18]。

2 結果與分析

2.1 GhMYB52基因的克隆及序列特征分析

以陸地棉 TM-1 的 20 DPA 纖維 cDNA 為模板，用一步克隆法獲得GhMYB52 基因的CDS。GhMYB52 基因全長為 672 bp，編碼 223 個氨基酸殘基。ExPASy 在線網站預測GhMYB52 基因編碼產物的相對分子質量約為26.06 kDa，等電點為9.83，R2R3 結構域位于第 1～55 個氨基酸序列 （圖1)。通過 BlastP 比對，在 TAIR 網站（https://www.arabidopsis.org/） 中篩選出 5 個與GhMYB52 蛋白序列相似度大于50%的擬南芥R2R3 類MYB 轉錄因子。氨基酸序列分析結果（圖 2） 表明，GhMYB52 蛋白的 N 端含有 1 個高度保守的 R2R3 結構域。根據 R2R3 類 MYB 轉錄因子C 端的保守性的差異，進一步將其分成25 個亞族。我們提取了擬南芥中R2R3 類不同亞族的58 個轉錄因子，系統進化樹的分析結果（圖3）表明，GhMYB52 屬于 R2R3 類 MYB 轉錄因子家族第21 亞族。

圖1 GhMYB52 蛋白結構域分析示意圖Fig.1 Structure analysis of GhMYB52 protein

2.2 GhMYB52基因的表達模式分析

陸地棉轉錄組數據顯示，GhMYB52 基因在棉纖維次生壁加厚期優勢表達，尤其是在15 DPA、20 DPA、25 DPA 的纖維中表達量很高。利用 qRT-PCR 方法分析了 TM-1 中GhMYB52 基因和海 7124 中同源基因GbMYB52 （GB_A12G3024）在花瓣、雌蕊、雄蕊、花托、－3～3 DPA 的胚珠、5～30 DPA 的胚珠以及纖維等不同組織中的表達情況。結果表明：在所檢測的組織中，GhMYB52 與GbMYB52 的表達情況基本一致，均在 15 DPA 的胚珠、15～25 DPA 的纖維中優勢表達（圖4），與轉錄組數據的表達情況基本一致，推測GhMYB52 基因可能在棉花纖維發育次生壁加厚期發揮功能。

圖2 GhMYB52 與擬南芥中MYB 轉錄因子保守域氨基酸序列比對分析Fig.2 The sequence alignment of MYB domain of GhMYB52 and related protein from A.thaliana

圖3 棉花GhMYB52 蛋白與擬南芥中R2R3 類MYB 蛋白的系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the GhMYB52 protein and R2R3 MYB protein in A.thaliana

2.3 GhMYB52蛋白亞細胞定位

蛋白序列分析顯示GhMYB52 蛋白包含核定位信號。為了驗證GhMYB52 蛋白是否具有核定位特性，在本氏煙葉片細胞中瞬時表達Gh-MYB52，結果（圖5）顯示，綠色熒光信號聚集在細胞核區域，說明GhMYB52 蛋白是1 個核定位蛋白。

2.4 GhMYB52轉錄激活活性分析

將轉化得到的含GhMYB52 基因的陽性單菌落涂在含有 50 μg·L－1AbA 抑制劑的 SD/-Trp培養基上繼續培養，結果（圖6）表明，菌落能夠正常生長，證明了GhMYB52 具有轉錄激活活性，是1 個轉錄激活子。

2.5 GhMYB52能與NAC類轉錄因子GhFSN1發生互作

圖4 GhMYB52 基因在棉花不同組織中的表達模式Fig.4 Expression profile of GhMYB52 gene in different tissues and different developmental stages

圖5 GhMYB52 在本氏煙中的亞細胞定位Fig.5 Localization of GhMYB52 in leaf cells of N.benthamiana

圖6 GhMYB52 轉錄因子的轉錄激活驗證Fig.6 Assay of GhMYB52 transcriptional activation activity

對過表達GhFSN1 基因植株的轉錄組數據分析，發現GhMYB52 基因的表達呈現正相關的上調趨勢[16]。為了進一步研究GhMYB52 參與棉花纖維次生壁加厚過程的機制，通過酵母雙雜交試驗的方法研究GhMYB52 蛋白與GhFSN1 蛋白之間的互作關系。酵母雙雜交的結果（圖7）顯示，GhMYB52 與GhFSN1 之間能夠發生較強的相互作用。

圖7 酵母雙雜交驗證GhMYB52 與NAC 類轉錄因子GhFSN1 互作Fig.7 Interactions of GhMYB52 with the NAC transcription factor GhFSN by yeast-two hybridization assay

3 討論

MYB 轉錄因子廣泛存在于植物各類組織器官中。目前，關于MYB 類轉錄因子的研究，主要集中在擬南芥、棉花、水稻等作物中[19-24]。大量的MYB 轉錄因子在植物的生長發育、 細胞分化過程中發揮重要的作用[25-29]。其中，MYB 轉錄因子在擬南芥的木質部導管細胞以及木質部、厚壁細胞的纖維細胞發育過程中的作用已經比較清楚：以NAC 和MYB 類轉錄因子為核心成員的一系列轉錄因子形成分級調控網絡，調節下游的一系列MYB 或者其他類轉錄因子參與次生壁中纖維素、半纖維素和木質素的合成過程[30-34]。

擬南芥中NAC 類轉錄因子基因SND1，主要在擬南芥的維管束間纖維及木質部纖維細胞中特異性表達，過表達SND1 能激活植物非厚壁組織細胞的次生壁合成，顯性抑制SND1 則能夠引起維管束間纖維和木質部纖維次生壁的厚度顯著下降。同時，SND1 能夠調控下游的一些MYB類 轉 錄 因 子 ，如MYB52、MYB54、MYB85、MYB103 等。在擬南芥中，抑制AtMYB52、At-MYB54 基因的表達使得擬南芥束間纖維細胞壁的厚度明顯下降[35-36]。不同物種的同一亞族成員可能具有類似的功能。本研究從陸地棉TM-1 中得到了1 個R2R3 類MYB 轉錄因子 GhMYB52，氨基酸序列和進化樹分析發現GhMYB52 含有1個R2R3 保守區和1 個核定位區，與AtMYB52進化關系最近，同屬第21 亞族。在TM-1、海7124中，GhMYB52 和其同源基因GbMYB52 均在棉纖維次生壁加厚期優勢表達，因此我們推測Gh-MYB52 基因可能參與棉纖維次生壁加厚期的發育過程。

目前已經基本掌握了雙子葉植物中次生壁的發育調控網絡，但是棉纖維次生壁的發育過程是否存在同樣的調控網絡，目前尚不清楚。2017年，李學寶團隊發現棉花中的NAC 類轉錄因子基因GhFSN1 能夠正向調控棉纖維次生壁厚度，過表達棉花植株的轉錄組數據表明，大量的MYB 類轉錄因子受到調控，其中GhMYB52 基因的表達受到GhFSN1 的正向調控[18]。我們通過酵母雙雜交試驗，在蛋白水平上驗證了Gh-MYB52 與GhFSN1 之間能夠發生較強的相互作用。這一結果進一步表明GhMYB52 基因在棉纖維次生壁發育過程中可能發揮重要的作用，為進一步研究棉花纖維次生壁加厚調控網絡提供了依據。

4 結論

本研究在本實驗室已有的研究基礎上，通過一步克隆法，從陸地棉中克隆了1 個R2R3 類MYB 轉錄因子基因。氨基酸序列保守性分析顯示，該基因編碼產物N 端含有1 個高度保守的R2R3 結構域，且與擬南芥的AtMYB52 基因具有較高的相似性，因此，將其命名為GhMYB52。GhMYB52 基因的 cDNA 序列全長 672 bp，共編碼223 個氨基酸殘基，蛋白的相對分子質量為26.06 kDa，等電點為9.83。瞬時轉化煙草結果表明，GhMYB52 定位于細胞核，且具有轉錄激活活性。TM-1 中的表達分析結果顯示，GhMYB52 基因在棉纖維次生壁加厚期優勢表達。酵母雙雜交的結果顯示GhMYB52 與正向調控棉纖維次生壁發育的NAC 類轉錄因子GhFSN1 發生較強的互作，表明GhMYB52 可能參與棉纖維細胞次生壁的形成，但它在棉纖維次生壁發育過程中的作用機制還有待于進一步研究。