對微生物限度檢查法藥品滅活方法的探索

賈培建

天津紅日藥業股份有限公司 天津 301700

2015年中國藥典致力于確定四種藥物微生物限度的方法，符合歐洲和美國標準。他的標準規定，特別是方法的適用性測試，自2010年版以來發生了重大變化。根據對測試的四個非無菌產品的微生物限量標準（在1105總則，一般原則1106），以確定該產品的微生物限度方法的限制的方法中國藥典2015年版已定，而該方法應用到三個產品批次經過測試。結果表明該方法是有效的。并且可能。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DL-CJ-2ND超凈工作臺(哈東聯)；1300SERIESA2生物安全柜(Thermo)；MIR-254型生化培養箱(SANYO)；電熱脈動真空滅菌器(山東新華)；PL2002電子天平(梅特勒)；MaxQ6000恒溫搖床(Thermo)。

1.2 試藥

地拉羅司分散片(國內A廠家，批號：108/109/903；規格：500mg)。

1.3 培養基

從胰臟豆粕液體培養基（批號：151210），胰蛋白酶Sojaagarmedium（TSA，批號：151210），補充有葡萄糖沙氏液體培養基（批號：151210），Sabur葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號）：151210），MacKangkai液體培養基（批號：151210），麥康凱瓊脂培養基（批號：151210）購自北京路橋技術有限公司購買；pH為7.0氯化物胨緩沖液：百分之0.9氯化鈉（稀釋劑，北京路橋科技有限公司，批號141213）注射（4種藥物石家莊，批號：1501273201），緩沖液，pH 7的0氯化物蛋白胨（含有百分之3聚山梨酯80和百分之0.3大豆）卵磷脂，批號：151217）。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC(F)98003]、大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B)44102]均為第3代，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

在10ml胰蛋白酶大豆根液體培養的金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的新鮮培養物接種在33℃24小時，接種白珍珠新鮮的細菌培養在10與葡萄糖液體三郎培養基中在23℃下進行24栽培了幾個小時。上述培養物通過的0.9%氯化鈉注射稀釋，以制備含有1~50 CFU和每1ml細菌的5000至10000 CFU細菌懸浮液。黑曲霉的新鮮培養在23℃下接種的Sabouraud右旋糖瓊脂培養基上，培養7天，加入含有0.05%聚山梨醇酯803毫升0.9%氯化鈉溶液，孢子被洗脫和菌絲過濾以吸出孢子。將懸浮液置于無菌管中并用含有0.05%聚山梨醇酯和0.9%氯化鈉注射液，稀釋，以制備每毫升注射液含菌數量可以達到30 CFU到60CFU細菌懸浮液和每毫升注射液含菌數量可以達到3000到6000CFU 的細菌懸浮液。

2.2 計數方法適用性試驗

2.2.1 計數培養基適用性檢查

取1毫升（30~100 CFU），金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和黑曲霉，其制備根據在無菌托盤，并倒入TSA培養皿進行觀察實驗，混合，固化，并在33攝氏度的溫度下栽培。金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌培養3天，白色念珠菌和黑曲霉是5天前培養。包括：1毫升（30~100 CFU）從白色念珠菌和黑曲霉中的每個制備的溶液服用，在無菌托盤給予，立即倒入SDA介質，預拌兩個板為平行和硬化測試的每種菌株。將細胞培養5天，在23℃，并在該測試培養基用用于上述測試的相應的控制培養基替換同時計數。當平均數目在培養基中的菌落的比例是在0.5~2范圍內進行控制介質菌落的平均數，并且符合與對照培養基中的集落的形態，該介質的適用性符合的要求測試。

2.2.2 供試液制備

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1:10的供試液，即為供試液A。取本品10g，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1:10的供試液。取1:10的供試液20mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80mL，即為1:50的供試液，取1:50的供試液10mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL，即為1:500的供試液。

2.3 常規法

采用常規平皿法篩查供試品有無抑制微生物生長的作用和抑制的微生物種類。菌液對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL，加入制備好的試驗菌液0.1mL（細菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu），混勻，使每1mL稀釋液中含菌量為30~100cfu。分別取此菌液1mL注皿，測定其每毫升的活菌數。試驗組：取供試液A10mL和制備好的試驗菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測定需氧菌總數。另取供試液A10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測定霉菌和酵母菌總數。供試品對照組：取“2.2.2”項下1:10的供試液10mL，加入稀釋劑0.1mL，混勻，取1mL注皿，在相應的條件下培養，測定供試品本底的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。

2.4 稀釋法和中和法聯用

中國藥典2015年版規定消除供試品抑菌性的主要方法包括稀釋法、中和法、薄膜過濾法以及上述方法的聯用。為了便于操作，本試驗僅改進了供試液的制備，選擇了稀釋法和中和法聯用，即將中和劑聚山梨酯80和大豆卵磷脂添加到稀釋液中，結合供試品的微生物限度標準，將供試品稀釋為1:50和1:500。試驗組：取1:500的供試液10mL和制備好的試驗菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測定需氧菌總數。另取1:50供試液10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測定霉菌和酵母菌總數。供試品對照組：取“2.2.2”項下1:500和1:50的供試液10mL，加入稀釋劑0.1mL，混勻，取1mL注皿，在相應的條件下培養，測定供試品本底的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。稀釋劑對照組：取含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL，加入制備好的試驗菌液0.1mL(細菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu)，混勻，使每1mL稀釋液中含菌量30~100cfu。分別取此菌液1mL注皿，測定其每毫升的活菌數[1]。

3 討論

微生物限度檢查方法學適用性試驗時采取常規平皿法，發現該藥品對微生物有較強的抑制作用，按照中國藥典2015年版的要求嘗試了幾種方法消除抑菌性，結合固體口服制劑的限度標準，如果僅采用稀釋法，抑菌性不能消除，因此本實驗結合使用了中和法。根據文獻報道，地拉羅司別稱4-3,5-二(2-羥基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸，由于化學結構的特性，決定其具有抑菌性。由于苯甲酸本身主要用于抗真菌及消毒防腐，在進行計數方法適用性試驗時，采用常規方法和常規的稀釋劑(pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)無法去除抑菌作用，因此，考慮使用稀釋法和中和劑(3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)聯用的方法進行計數方法適用性試驗，結果各試驗菌株回收率比值達到藥典要求的0.5~2.0之間。

考慮到平皿法比薄膜過濾法操作方便、簡捷，因此本試驗菌落計數方法采用稀釋法和中和法聯用，控制菌檢查采用稀釋的方法進行。本研究可為不同來源的地拉羅同類產品微生物限度檢查提供參考。