淺談食品微生物檢驗中大腸菌群測定的注意事項

周燕霞

洽洽食品股份有限公司 安徽合肥 230601

在食品微生物檢驗中，大腸菌群是評價食品衛生質量的重要指標之一。大腸菌群是指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏無芽孢桿菌。調查研究表明，大腸菌群多存在于溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，人畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。

在食品微生物檢驗中，大腸菌群檢驗大多采用大腸菌群平板計數法，主要原理為大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸，在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色，帶有或不帶有沉淀環的菌。在食品微生物檢驗大腸菌群測定當中，對相應的事項加以注意，從而取得更為準確的檢測結果[1]。

1 樣品采集

樣品的采集應遵循隨機性、代表性的原則，采樣時檢查樣品是否完整，是否有破損情況。根據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存狀態下送檢。如果發現有下列情況之一者，可拒絕檢驗：

（1）樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。

（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。

（3）按規定采樣數量不足者。

對送檢符合要求的樣品， 檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創造條件，然后進行檢驗[2]。

2 器具和稀釋液

在大腸菌群檢測中，實驗中使用的試管、移液槍槍頭、培養皿、鑷子、剪刀等，用牛皮紙包扎，必須都經過高壓蒸汽滅菌鍋在121℃下滅菌15min，并用滅菌指示條驗證滅菌效果。試驗中使用的225mL稀釋液稱量瓶和9mL稀釋液試管，都需要經過高壓蒸汽滅菌鍋在121℃下滅菌15min。滅菌前，避免9mL稀釋液試管塞由于高壓蒸汽噴出，試管塞不要塞得過緊。同時，從滅菌鍋取出時，應按壓試管塞，以免高壓蒸汽使其過松。

3 樣品稀釋

在無菌室內，按照無菌操作取25克或25毫升樣品進行稀釋，于225毫升滅菌稀釋液中進行剪碎放置，經過充分振蕩，稀釋為1：10的溶液。根據實際的檢測要求和對樣品污染情況的估計，將溶液配置為10倍遞增稀釋液。每次稀釋后，必須對滅菌移液槍槍頭進行更換。稀釋過程中，移液槍槍頭不能與容器口外側和其他位置接觸，避免帶入其他污染物。在加入9mL稀釋液時，應沿試管壁緩慢加入，避免接觸稀釋液。

4 平板接種培養

不同梯度的稀釋液，應接種2個平板，用滅菌移液槍槍頭吸取1mL稀釋液加入其中。大腸菌群平板培養所用的培養基為結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），配置方式按照瓶身使用說明，加熱煮沸，煮沸不超過2min，并在3小時內使用完。配置好的VRBA培養基在46℃恒溫水浴中保溫，以備后續使用。如果超過了限定溫度，可能會對大腸菌群生長造成影響。而如果溫度過低，則瓊脂容易發生凝固，難以均勻的混合。在對平皿進行傾注的過程中，應傾入15～20毫升，避免太薄干裂或太厚影響后續證實實驗的菌落挑取[3]。對于帶有沉淀的瓊脂底部，應當進行舍棄。在加入平皿之后，為了避免片狀大腸菌群產生，應當將培養基快速傾注混合，然后進行旋轉混勻。對于被檢樣品來說，從最初的稀釋到最后的傾注，時間應當控制在20分鐘以內。在大腸菌群測定中，為了對污染進行更好的控制，應當進行空白對照實驗。

5 證實實驗

接種環和鑷子等金屬工具，需將鎳鉻絲環口等接觸培養基的地方在火焰的氧化焰部位灼燒至紅，以避免接種環上可能存在的微生物污染培養基，然后將其余可能伸人試管或培養皿的部分均勻地通過火焰，需冷卻后進行接種以免溫度太高殺死菌種。接種時，也需在酒精燈火焰周圍進行，以保證無菌環境。根據生長的菌落大小及形態，判斷挑取典型菌落和可疑菌落，典型菌落為紫紅色，周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5mm或更大，可疑菌落直徑較典型菌落直徑小。若肉湯管中小導管是否產氣很難判斷，可輕輕晃動試管，將試管傾斜一定角度，如果有大量小氣泡從底部升上來，并有逐漸增多的趨勢，此時可判定為陽性

6 培養及廢棄物處理

培養過程中，避免頻繁打開培養箱，隨時監控培養箱溫度，保證其在適宜的溫度進行培養。經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在指定地點，待統一進行高壓滅菌（121℃30min）方可處理。打碎的培養物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

7 環境的影響

檢測時，窗戶和空調要關閉，定期開啟紫外燈，對房間進行殺菌處理。檢測前，將超凈臺內部進行清潔，用 75%酒精進行擦拭消毒，并提前半小時將超凈臺紫外燈打開，對超凈臺內部環境進行殺菌。.每次檢測后，要對超凈臺內部進行清理、清潔，并用75%酒精進行擦拭消毒。紫外燈根據其使用壽命要及時更換。檢測同時，要做上相應菌落檢測的環境空白。不得隨意出入無菌間，如需要傳遞物品，可通過傳遞窗傳遞。整個實驗過程應在酒精燈火焰的外焰保護區域進行操作。

8 結語

食品安全關系到消費者健康不容忽視，人們對食品安全問題重視程度也在不斷提高，對應的食品安全檢測問題必須引起重視，確保得到食品相對應的準確結果。