四氯化碳不同條件下復制大鼠肝纖維化模型的比較

梁潔 孟根斯立木 顏羽昕 王昕 金蓉 蘇曉麗 馬月宏 謝敏琦

試驗研究

四氯化碳不同條件下復制大鼠肝纖維化模型的比較

梁潔①孟根斯立木①顏羽昕①王昕①金蓉①蘇曉麗①馬月宏①*謝敏琦②

（①內蒙古醫科大學基礎醫學院 內蒙古 呼和浩特 010110 ②內蒙古自治區第三醫院）

為了探討四氯化碳在不同條件下建立肝纖維化動物模型的最佳方法，將大鼠分為5組。除正常組外，各組采用不同條件的四氯化碳造模法，每周給藥2次。8周后，測定血清谷丙氨酸轉氨酶、天門冬氨酸轉氨酶和堿性磷酸酶；取肝臟組織作病理阿學相關檢查。結果表明，各試驗組大鼠均表現出肝纖維化，其中腹腔注射組程度最嚴重，灌胃2組程度最輕。結論：本研究中不同方法都能成功制作肝纖維化大鼠模型，但肝纖維化程度有所不同并且各有利弊，其中灌胃2組最為理想。

肝纖維化 四氯化碳 疾病模型 大鼠

肝纖維化(Hepatic Fibrosis, HF)是一種慢性肝損傷疾病，主要發病原因有病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、寄生蟲感染、化學毒物感染及自身免疫性疾病等[1-3]。如果長期累積，損傷因素不去除，將會導致肝硬化和肝癌等嚴重后果，危害人類健康。所以，為了探索制造肝纖維化動物模型的最佳方法，本文比較了幾種不同的造模方法，以期篩選出成熟最優秀的肝纖維化造模方案，為研究肝纖維化發病機制以及相關治療藥物打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 高速冷凍離心機、725型紫外分光光度計(島津UV-2550)、電子分析天平、顯微鏡(奧林巴斯BX51)、切片機(LEICA SM2010 R)、水合氯醛(批號20141007，天津福晨化學試劑廠)、CCl4(批號20140319，國藥集團化學試劑有限公司)、實驗前用滅菌精制花生油配成50%濃度、花生油(山東魯花集團產品)、ALT、AST、AKP測定試劑盒(南京建成生物工程公司產品)。

1.1.2 試驗動物 Wistar大鼠40只，雄性，體質量190~220g，8周，清潔級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。飼養于內蒙古醫科大學實驗動物中心[SYXK(蒙) 2015-0001]，動物自由進食、飲水，飼喂標準顆粒飼料，室溫18~22℃，適應性飼養1周后使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及處理

表1 動物分組及處理

1.2.2 樣品采集及肝臟病理學檢查 試驗第8周末禁食不禁水12h后，各組大鼠分別腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經腹主動脈取血，靜置20min后，4℃ 3500r/min離心10min，分離血清，根據各試劑盒的說明書測定谷丙氨酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)的濃度。取1葉肝臟，于4%甲醛溶液中固定，脫水、包蠟、切片及HE和Masson三色染色，光學顯微鏡下觀察。觀察肝臟組織結構變化以及炎癥反應并進行Ishak肝纖維化程度評分[4]。將各組肝臟標本進行Masson三色染色，選中視野中藍染區域即纖維組織，使用Image J軟件測定視野中肝纖維化病變所占面積。

1.3 統計學處理

使用SPSS 24.0軟件進行數據分析。組間比較采用One-Way ANOVA法比較。

2 結果

2.1 大鼠表征

大鼠一般健康狀況在一定程度上可以反映造模水平，具有參考價值。A組大鼠健康狀況良好，飲食、飲水正常，行動敏捷，體重自然增長，大便成形，毛色有光澤，無死亡，明顯優于其他幾個試驗組。B組大鼠活動減少，有時可見大便不成形，皮毛雜亂，頸后皮膚有潰爛，精神倦怠，試驗結束時，死亡1只。C組大鼠精神萎靡，易激怒，大便不成形，飲食飲水顯著減少，皮毛雜亂無章，體重先增加不明顯，后有所增加，腹部明顯鼓脹，推斷已經產生腹水，試驗結束時，死亡4只。D組大鼠活動減少，精神欠佳，偶爾出現大便不成形，飲食正常、無明顯變化，皮毛稍顯雜亂，體重稍有增加。E組大鼠精神不佳，活動明顯減少，有時易激怒，偶可見大便不成形，飲食減少，皮毛毛躁雜亂，體重稍有增加，試驗結束時，死亡1只。

2.2 各組大鼠ALT，AST，AKP的變化

表2 各組大鼠ALT，AST，AKP的變化

注：與正常組A組相比：*P<0.05差異顯著，**P<0.01差異極顯著。下表類同。

從試驗結果可以看出，各試驗組血清中酶的含量與A組比都有顯著性差異，說明肝臟都有不同程度的損傷。其中C組損傷最嚴重，B、E組次之，D組相對最輕。

2.3 各組大鼠肝臟外觀比較

A組大鼠肝臟顏色鮮紅，柔軟，光滑，觸摸沒有顆粒感；其余各組大鼠肝臟顏色均暗淡，C組大鼠甚至呈現黃色，說明肝臟病變嚴重。除此之外，各試驗組大鼠肝臟都較硬，B組大鼠觸摸有顆粒感，C組大鼠變硬且壞死嚴重，D、E組大鼠肝臟有不同程度的變硬。

2.4 各組大鼠肝臟組織病理學切片觀察

從HE、Masson染色病理組織中可以看出，A組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，胞漿均勻，未見變性壞死、炎癥細胞浸潤、纖維組織增生。其余各組均有不同程度的大鼠肝小葉結構破壞，肝板排列混亂，炎癥細胞浸潤，纖維組織增生。此外，B組樣本出現大小不一的脂滴；C組樣本形成明顯的假小葉，肝細胞出現氣球樣病變；D組樣本有大量炎癥細胞浸潤；E組樣本可見明顯的橋間連接以及少量假小葉。

2.5 Image J測定肝纖維化病變總面積

附圖 各組大鼠肝纖維化病變總面積

Image J軟件可以測定Masson染色病理切片中藍色膠原部分的面積，從而可以檢測肝纖維化導致肝臟的病變面積。與正常組大鼠相比，其余各實驗組大鼠肝臟病變總面積均有顯著性差異，但各實驗組大鼠之間比較沒有明顯差異。但也能從數據看出，C組大鼠病變面積最大，纖維化程度最嚴重，E組，B組次之，D組大鼠肝纖維化病變總面積相對最少。

2.5 肝纖維化程度Ishak評分結果

表3 各組大鼠Ishak評分結果

Ishak評分系統0分表示無纖維化病變；1分表示部分門管區有纖維增生，有或無短的纖維隔膜；2分表示大多數門管區有纖維增生，有或無短的纖維隔膜，3分表示大多數門管區有纖維增生，偶見門管區以纖維橋連；4分表示門管區纖維增生，同時伴有明顯橋連；5分表示有明顯的橋連，偶見結節；6分表示可能或明確的肝硬化。A組大鼠全部顯示無纖維化病變,其余各組均出現肝纖維化病變。B組大鼠評分在3~5之間，有明顯的纖維化，其中個別大鼠程度較嚴重；C組大鼠纖維化程度嚴重，甚至有肝硬化出現；D組大鼠評分3~4之間居多，是較理想的肝纖維化模型；E組大鼠肝纖維化程度也較嚴重，有肝硬化出現。

3 討論

（1）肝纖維化是肝臟疾病發展過程中的重要節點，正確認識并及時治療可以有效控制疾病的發展[5]。為了研究疾病的發病機制及治療藥物，必須建立適宜的動物模型。諸多文獻[6-9]研究顯示，制造肝纖維化動物模型有多種方法，可以分為化學藥物誘導法[10-12]、免疫法[13]、膽管堵塞手術法[14]等。其中，化學藥物誘導法中四氯化碳誘導法是最經典的一種方法[15]，而且造模途徑多樣。有研究報道，復合因素法可以提高肝纖維化模型的成功率，同時減短造模周期[16, 17]；腹腔注射法成模率高，造模周期短，但動物死亡率也高[18]；灌胃法操作簡單，動物耐受性好，但造模周期長，成模較困難[19]。所以，本文比較了不同方法的利弊。同時，目前臨床對于肝纖維化的檢測并沒有特異性的診斷方法[20]，一般通過檢測肝功能三項，即谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶的濃度來判斷肝細胞的損傷情況；此外肝纖維四項，即透明質酸、Ⅲ型前膠原、層黏連蛋白、IV型膠原，在一定程度上也可以反映肝纖維化程度；較準確的方法是通過肝臟組織切片來推斷肝纖維化進程。本實驗通過記錄大鼠一般生理狀況，檢測血清肝功三項指標，臨床上常使用檢測血清中酶的變化來反映肝臟的功能以判斷肝臟的損傷程度，所以本試驗也選取了這一指標。肝臟損傷伴隨肝細胞的變性壞死、破裂，進而使存在于細胞內的酶進入到血清中，通過測定血清中酶的含量可以反應肝細胞受損情況及損傷程度。觀察大鼠肝臟大體形態，制作HE、Masson染色病理切片并評分、計算來判斷大鼠肝纖維化程度，并總結實驗過程中出現的重點及難點問題來初步判斷幾種模型的優勢和劣勢。（2）B組復合因素皮下注射造模法皮下注射方法比較簡單，形成肝纖維化時間較短，但皮下注射易導致大鼠皮膚潰爛，應采用碘酒消毒以防皮膚損傷；同時，高脂乳劑灌胃較難操作，大鼠易嗆，易致死，所以需要避免一次性給藥，應該少量多次，這一點造成工作量增加；此外，從病理切片看，該組大鼠肝組織多有脂滴出現，有形成脂肪肝的傾向，導致肝纖維化造模不夠準確。（3）C組腹腔注射形成肝纖維化時間短，成功率高，但對大鼠傷害較大。大鼠在腹腔注射后有長時間的激怒狀態，易造成大鼠之間互相攻擊，導致不必要的傷害。同時，大鼠精神萎靡，飲食飲水均減少，死亡率也隨之升高。此外，從病理切片來看，腹腔注射造模法容易造成肝纖維化程度變重，甚至有肝硬化的發生，所以應該酌情減少造模時間來控制病情程度。（4）D組、E組灌胃法優點在于CCL4可直接經門靜脈到達肝，一般在1.5h左右肝內即可達最高水平。同時操作簡單，大鼠耐受性較好，傷害小，死亡率低。但成模時間長，容易逆轉。同時劑量和時間不易把握，可能出現造模過輕或過重的情況。采用首劑加倍來制備模型，隨時觀察大鼠反應，調整給藥劑量及時間，能夠更好地提高造模成功率。

4 結論

本試驗設計的D組，即使用50%CCl4以2ml/kg灌胃，連續8周制作的肝纖維模型效果最好，纖維化程度較符合要求，操作過程簡便，對大鼠的損傷較小，可以作為制作肝纖維化模型的一種常用方法；而B組在實驗過程中應用高脂乳劑，有些大鼠出現了脂肪肝的傾向，而且高脂乳劑在灌胃時較困難，不容易灌入，易溢出，此類造模方法更適用于因脂肪肝造成的肝纖維化疾病的模擬；C組肝纖維化程度重，腹腔注射刺激性大，大鼠耐受性不好，注射后有較長一段時間大鼠處于應激易怒狀態，更適用于肝硬化的造模；E組肝纖維化程度較C組輕，但較D組重，合理把握、適當減少灌胃周期，或許也能成為另一種制作肝纖維化模型的可行方法。

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國家自然科學基金項目(81560706)；內蒙古自然科學基金資助項目(2014MS0841)；內蒙古自治區青年創新人才培訓計劃項目；內蒙古醫科大學人才團隊項目

S818.9

A

1007-1733(2019)11-0001-04

（2019–08–14）