某豬場豬瘟和圓環病毒2型混合感染的診斷與防治

李麗娜

某豬場豬瘟和圓環病毒2型混合感染的診斷與防治

李麗娜

（山東省萊陽市動物疫病與控制中心 265200）

豬瘟病毒和圓環病毒2型是當前嚴重危害養豬業的重要傳染病，豬瘟以高發病率和高死亡率著稱，圓環病毒2型感染后會引起PMWS、PDNS等疾病，還會侵害豬的免疫系統，降低豬體對各種疾病的抵抗力。

豬瘟俗稱"爛腸瘟"，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發熱、接觸性傳染傳染病?？杀憩F為急性、亞急性、慢性、不典型或不顯癥狀的病程。具有高度傳染性和致死性。本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發生。豬圓環病毒2型(PCV2)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，病毒粒子大小為14~25nm，無囊膜，基因組為單股環狀DNA，嚴重侵害豬的免疫系統，病毒與巨噬細胞/單核細胞、組織細胞和胸腺巨噬細胞相伴隨，導致患豬體況下降，形成免疫抑制。臨床癥狀最常見的是豬只漸進性消瘦或生長遲緩，其他癥狀有厭食、精神沉郁、行動遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難，咳嗽為特征的呼吸障礙。

2018年11月份，山東禹城某養豬場自繁自養，母豬存欄量100頭的養殖場發生疫情，保育舍300頭存欄，部分保育舍豬出現體溫升高至41~42℃，食欲減少，沉郁，眼、鼻黏膜充血，極度衰弱。發病豬不食、精神差、喜臥、弓背、寒戰等癥狀外，其他典型癥狀有眼結膜發炎，有膿性分泌物，有時可見眼結膜小點出血。鼻黏膜發炎，有膿性分泌物。病初便秘，糞便發黑，如算盤珠子。病后期腹瀉、惡臭、糞帶黏液或血。在病豬鼻端、耳后、腹部、四肢內側等皮薄毛稀處可見大小不等的紫紅色斑點，指壓不褪色；有的豬只漸進性消瘦，皮膚蒼白、被毛蓬亂、呼吸困難。一般發病后5~7d死亡，發病率達到60%，死亡率50%以上。使用多種抗生素藥物治療均無效。懷疑該豬場同時感染了豬瘟病毒和圓環病毒。為了對該豬場病情進行確診，本研究對疑似病例進行了病理解剖、RT-PCR/PCR基因組核酸檢測，對感染豬病原做出了準確判斷，為及時采取針對性的緊急防疫和對癥用藥提供了依據。

1 材料與方法

1.1 病理剖檢和樣品采集

對2例病死豬進行解剖，觀察豬內臟器官如淋巴結、肺、脾、腎、喉頭和氣管的病理變化。分別采集病豬的扁桃體、淋巴結、腎、脾、肺組織各少許，-20℃低溫保存備用。同時采集2頭發病活豬的血液2ml，2000rpm離心取血清冷凍保存。

1.2 材料和試劑

CSFV和PCV2陽性對照由本實驗室保存；RT-PCR/PCR一步法試劑盒、凝膠回收試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.3 引物設計與合成

1.3.1 CSFV引物設計與合成 CSFV引物由本實驗室設計，在上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增片段大小為250bp。引物序列為F：5’-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3’，R：5’-GAT TCAACTCCATGTGCCATG-3’。

1.3.2 PCV2引物設計與合成 PCV2引物引物由本實驗室設計，在上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增片段大小為721bp。引物序列為F：5’-CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT-3’，R：5’-TAGATTACACAGTCTCAGTAG-3’。

1.4 樣品的處理與DNA/RNA提取

取2g左右的病料于研磨器中剪碎并研磨，加入適量的PBS研磨混勻后放入1.5ml離心管中-20℃反復凍融3次，5000rpm4℃離心2min；取250ml上清放入另一個1.5ml離心管中，加入750ml Trizol和200ml氯仿，震蕩混勻，-20℃靜置5min，12000rpm 4℃離心15min；取500ml上清加入等量的異丙醇，顛倒數次，-20℃靜置20min，12000rpm 4℃離心15min，倒掉上清，收集沉淀；75%酒精1ml洗滌沉淀，吸凈水，干燥，加入20ml滅菌水溶解沉淀即為樣品DNA/RNA，-80℃保存備用。

1.5 PCR/RT-PCR擴增

（1）利用一步法RT-PCR對CSFV核酸進行檢測，具體操作如下：反應體系為25ml，其中：2× One Step PrimeScript? III RT-qPCR Mix12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，RNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反應程序為：50℃ 30min(反轉錄)，95℃ 2min(預變性)；94℃ 1min(變性)，52℃ 1min(退火)，72℃ 1min(延伸)，重復30個循環。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行條帶檢測。（2）利用PCR對PCV2核酸進行檢測，具體操作如下：反應體系為25ml，其中：2×PCR Master mix 12.5ml，上、下游引物F、R(10mmol/L)各1ml，DNA模板3ml，RNase-free ddH2O 7.5ml。反應程序為：94℃ 3min(預變性)；94℃ 40s(變性)，55℃ 40s(退火)，72℃ 40s(延伸)，重復35個循環。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行條帶檢測。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢

解剖該豬場送檢的2例病死豬，發現以下病理變化：喉頭出血嚴重；下頜和腹股溝淋巴結腫大出血，切面呈大理石花紋樣；肺有一病例汽腫或萎縮出血，尖頁處有肉變現象，顏色發白；脾臟邊緣出現多處黑色梗死；腎臟出血嚴重，成麻雀蛋樣，貧血發黃；腸系膜淋巴結腫大；膀胱粘膜散布點狀出血。根據剖檢的病理變化可以初步判斷為這兩例病死豬為豬瘟病毒和豬圓環病毒2型感染，并結合實驗室診斷進行確診。

2.2 RT-PCR檢測結果

采集的兩例病料提取RNA后，進行RT-PCR擴增，電泳結果顯示，兩例病料樣品都有一條272bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致(圖1)，且為強陽性。說明所檢的兩個樣品為CSFV陽性(表1)。

表1 采用RT-PCR方法對豬瘟病毒的抗原檢測結果

2.3 PCR檢測結果

采集的兩例病料提DNA后，進行PCR擴增，電泳結果顯示，病料1樣品有一條648bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致(圖2)，且為強陽性。說明所檢的病料1樣品為PCV2陽性(表2)。

表2 采用PCR方法對豬II型圓環病毒的抗原檢測結果

圖1 RT-PCR擴增產物凝膠電泳結果

圖2 PCR擴增產物凝膠電泳結果

2.4 結果判定

通過病理解剖、PCR和RT-PCR對樣品進行檢測后，確診該豬場病死豬為豬瘟病毒和豬圓環病毒2型混合感染。

3 討論

（1）對豬瘟的診斷，在臨床上可以通過該病的臨床癥狀和病理解剖做出初步的診斷。如果該豬群再混合感染其他一些疾病，就很難通過肉眼的觀察來診斷該豬群的疾病發生情況。而且近幾年來豬瘟的流行情況和發病特點發生了很大的變化，呈多樣性、非典型性，這就使豬瘟在臨床病變上沒有明顯的和非常典型的病變。在加上其他疾病的侵擾，給豬病的臨床診斷帶來了不小的麻煩。所以如需準確的診斷還需要通過實驗室手段。目前實驗室多采用一步法PCR/RT-PCR法快速進行檢測，提高了檢測效率，還能最大限度的減少了操作過程中污染和假陽性情況的出現。（2）本研究采用臨床剖檢和實驗室檢測，對該豬群豬瘟病毒和圓環病毒2型的疑似病例進行了準確的診斷，并指導該豬場采取相應的有效措施對全群豬進行防治。全群保育豬緊急免疫豬瘟細胞苗，2頭份/頭，一周后再注射圓環病毒II型疫苗1頭份/頭。同時為了防止豬群保育豬繼發感染其他細菌病，在其飼料中添加30%的阿莫西林(250g/t飼料)和黃芪多糖提取物(500g/t飼料)。對發病比較嚴重的個體按照體重注射頭孢噻呋鈉和黃芪多糖注射液，連續注射3~5d。全群保育豬飲水中加入維生素C和電解多維，連續飲水1周，較少由于疾病和注射疫苗對豬體造成的應激。（3）對病死豬及時進行深埋或無害化處理，嚴格控制發病豬的流動，防治疫情進一步擴散。保持飼養工具的潔凈，加強通風，改善豬舍飼養環境。進行嚴格消毒制度，對全場用具、飼養環境和周圍環境消毒，每兩周一次環境大消毒，每周兩次帶豬消毒。

由于診斷及時準確，并為其提供了一套系統的防治措施，在嚴格提供的防治措施執行后疫情的到了有效的控制，3d后豬群不再有死亡個體，采食量有所增加。10d后豬群的采食量和疫情都控制住。

（2019–08–18）

S858.28

B

1007-1733(2019)11-0036-03