大麻二醇對高糖條件下視網膜微血管內皮細胞表達VEGF的影響及機制

張嬋 譚鋼

421001南華大學附屬第一醫院眼科1，湖南 衡陽

417000湖南省婁底市愛爾眼科2，湖南 婁底

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病最常見的并發癥之一，也是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因。血管內皮功能障礙被認為是DR發生的重要病理生理改變，包括毛細血管基底膜增厚，內皮細胞和周細胞丟失，視網膜屏障受損和滲漏，以及新生血管化[1]。在視網膜血管生成的生長因子中，血管內皮生長因子(VEGF)被認為是主要的介導因子[2]。大麻二醇(CBD)是從大麻中提取出來的一種植物大麻素。現代藥理學研究顯示，CBD在癌癥、糖尿病、炎癥和神經退行性疾病方面具有一定療效，并且對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病和血-視網膜屏障具有保護作用。本研究旨在觀察CBD對HRCECs增殖及VEGF 表達的影響，并初步探索VEGF可能的調控機制。

資料與方法

細胞培養與處理：HRCECs 于含10%胎牛血清的DMEM 細胞培養基內，37℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。細胞分為6 組：P0組(空白對照)：僅加入等體培養基；P1組(溶劑對照組)：加入0.5%乙醇作為溶劑對照；P2組(低糖對照組)+0.5%乙醇：葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L+0.5%乙醇；P3組(高糖對照組)：葡萄糖濃度為22 mmol/L+0.5%乙醇；P4組：P3+1 μ mol/L 大 麻 二 醇(CBD)；P5組：P3+10 μmol/LCBD。

細胞增殖分析：將0.5%MTT溶液分別加入各孔，繼續培養4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶解，置搖床上使結晶溶解完，上機檢測，490 nm 波長，測定各孔吸光度(A)值，實驗重復3次，計算細胞活力。

實時定量PCR 檢測VEGF mRNA 表達：使用TRIzol 試劑提取總RNA，在20 μL反應中使用1 μg總RNA和隨機六聚體進行逆轉錄反應，設計人VEGF 基因的引物，在實時定量PCR 儀上進行PCR。采用比較閾值循環(CT)方法，通過計算其與管家基因β-actin的比值確定相對基因表達水平。

Western blot檢測VEGF蛋白表達及FOXO3a 磷酸化：用裂解緩沖液在4℃下裂解60 min 以提取細胞總蛋白。將蛋白質樣品經12% SDS-PAGE 處理后，電轉印至硝酸纖維素膜上，經封閉后，加入相應的一抗4℃孵育過夜，充分洗膜后加入HRP 標記的二抗室溫孵育1.5 h。最后采用化學發光法顯影并檢測信號。

結 果

大麻二醇對高糖條件下HRCECs 增殖的影響：MTT 結果顯示，在相同的時間點，高糖組細胞增殖率明顯高于低糖組，并且隨著時間的延長，細胞活性逐漸增高；而分別加入1 μmol/L 和10 μ mol/L CBD 處理后，與高糖組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)；且隨著CBD濃度的升高，細胞活性有所降低。

大麻二醇對體外培養的HRCECs 中VEGF mRNA和蛋白表達的影響：實時定量PCR 結果顯示，對P1溶劑對照組和P2低糖組細胞VEGF mRNA 表達無明顯影響，而P3高糖組VEGF mRNA 表達明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。給予CBD 處理后，P4和P5組VEGF 表達水平明顯降低。此外，Western blot 結果也顯示，VEGF 蛋白表達水平與mRNA 類似。見圖1。

圖1 CBD對高糖條件下HRCECs中VEGF蛋白表的影響

大麻二醇對體外培養的HRCECs 中FOXO3a 磷酸化影響：Western blot 結果顯示，P0空白組和P1溶劑對照組組細胞中FOXO3a 第253 位絲氨酸(Ser253)磷 酸化水平較低，P2低糖組和P3高糖組均有不同程度的增高。而加入1 μmol/L 和10 μmol/L CBD后，Ser253磷酸化水平隨之減少。

討 論

本研究采用MTT 法觀察了高糖(22 mmol/L)和低糖環境下(5.5 mmol/L)HRCECs 的增殖情況，結果發現高糖環境對HRCECs 的增殖具有促進作用，與相關報道相符。VEGF 是血管內皮細胞生長的中心環節。既然高糖環境能促進HRCECs 增殖并上調VEGF 表達，那么可以通過干預VEGF 過度表達的方式間接抑制血管內皮細胞增殖，從而達到延緩PDR 的目的[3]。本研究采用高低兩種劑量的CBD 作用高糖條件下的HRCECs，發現細胞的活性受到抑制。實時定量PCR 和Western blot 結果顯示，CBD 處理也能下調VEGF mRNA 和蛋白的表達水平，說明土槿乙酸抑制體外HRCECs的增殖可能與下調VEGF的表達有關。FOX 蛋白是廣泛參與細胞增殖分化的一類轉錄因子，其中以FOXO3a 最重要。本研究結果顯示，空白對照組中Ser253 磷酸化水平較低，高糖條件下Ser253 磷酸化水平明顯增高。但給予CBD 孵育后，Ser253 磷酸化水平明顯減少。總之，本實驗證實CBD 能夠抑制高糖培養條件下HRCECs 的增殖，并能抑制VEGF 的表達，其機制可能與激活核轉錄因子FOXO3a 的活性有關。但本研究僅僅為體外實驗，并且只考慮了VEGF，事實上PDR 發病機制復雜，多種發病機制相互影響，加之VEGF受多重信號通路調控，因此以上一系列問題需要進一步研究。