藍莓外植體不同取材時間滅菌方法研究

周閏 周玲紅 申超峰 鄧朝艷 黃麗芳

摘要：選用兔眼藍莓“燦爛”當年生半禾質化帶腋芽莖段做外植體。從3月下旬至6月下旬共7次取材，根據(jù)外植體木質化程度的不同，選取不同的消毒試劑和消毒時間，為篩選出不同取材時間最適合的滅菌方法進行了實驗，結果表明：“燦爛”最佳的取樣時期是4月份，最佳滅茵方法是將莖段分為嫩部及半木質化部兩部分，嫩部用0.1%升汞滅菌6～7min最佳，其污染率為4.4%～6.7%，褐化率為6.7%～11.1%·萌芽率達到84.5%～86.7%;半木質化部用0.1%升汞滅茼10～11rain最佳，其污染率為4.4%～13.3%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達到84.5%～88.9%。

關鍵詞：藍莓;組織培養(yǎng);取材時間;滅茵方法

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）19-0169-03

1引言

藍莓（Blueberry），又名越橘或漿果，杜鵑花科，越桔屬，多年生灌木小漿果果樹。藍莓果實風味獨特，營養(yǎng)豐富，被譽為“世界第三代水果之王”。藍莓低糖、低脂肪、抗氧化能力強，還具有增強人體免疫力、抗癌、延緩衰老，防止腦神經老化、強心、軟化血管等功能，因此被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一。由于果實具有獨特的風味及營養(yǎng)保健價值，藍莓作為一種高檔水果深受市場歡迎，栽培藍莓的經濟效益顯著。

中國藍莓產業(yè)發(fā)展相對較晚，大部分品種均引自國外，優(yōu)良品種相對較少，為促進藍莓產業(yè)的發(fā)展，需在短期之內獲得大量的優(yōu)質種苗，而藍莓的常規(guī)繁殖方法速度較慢、繁殖規(guī)模受到阻礙且苗木在生長勢、果實品質等諸多方面存在不足，故進行工業(yè)化批量生產，則需利用組培快繁技術。

在組織培養(yǎng)中，外植體的滅菌效果直接關系到后續(xù)芽誘導的效果及組培苗的成活率，確定合適的滅菌方法在生產實踐中尤為重要。實驗旨在比較研究不同取材時間采取不同滅菌方法對藍莓外植體滅菌效果的影響，最大限度降低外植體的污染率，為藍莓規(guī)?；M培快繁生產實踐提供理論參考。

2材料與方法

2.1供試材料

組培所用的藍莓外植體為兔眼藍莓品種“燦爛”，于2019年3～6月份共7次采自于郴州市農科所保和果蔬基地五年生的藍莓植株，取樣時間分別為3月26日、4月9日、4月25日、5月7日、5月23日、6月5日、6月23日。

2.2方法

2.2.1材料處理

在連續(xù)天氣晴朗3d后的上午11：00剪取枝條，選取生長旺盛、無病蟲害的當年生的健壯嫩梢，將葉片去掉，留少量葉柄，在水龍頭下用流水沖洗干凈，然后將枝條分為半木質化部及嫩部兩部分，其中半木質化部的枝條剪成長約1～2cm的帶腋芽莖段，嫩部則剪成長3～4cm帶腋芽莖段。剪取的藍莓莖段，直接加無菌水放置于恒溫震蕩器上震蕩0.5～1h，期間更換無菌水2次，濾干水后置于超凈工作臺上進行外植體滅菌。

2.2.2外植體表面消毒

半木質化部的莖段先用75%酒精浸泡30S，倒出酒精，用無菌水清洗一遍，再用含0.1%吐溫80的0.1%升汞溶液浸泡10～15min;嫩部莖段直接用含0.1%吐溫80的0.1%升汞溶液浸泡5～9min。消毒時不斷搖動，消毒后的莖段用無菌水清洗5次，濾干水分，再用無菌濾紙吸干水分備用。切去兩端受損組織，嫩部莖段還需再剪成1～2cm長的帶腋芽的莖段，按無菌操作要求接種于初代培養(yǎng)基上，每瓶接種1個莖段。然后放置于培養(yǎng)室，觀察不同滅菌處理的效果。

2.2.3培養(yǎng)條件

試驗以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加玉米素（ZT）和NAA作為外源激素：ZT濃度為1.0mg/L，NAA濃度為0.01mg/L，培養(yǎng)基中蔗糖含量為3%，瓊脂含量為0.65%，pH值調至5.8，將配制好的培養(yǎng)基置于121℃，1.1kg/cm²壓力下高溫滅菌20min。接種好的材料在23～28℃，12h/d光照，2000lx光照強度下進行培養(yǎng)。

2.2.4數(shù)據(jù)處理

接種后定期記錄材料情況，接種20d后統(tǒng)計污染率、褐化率、萌芽率。

污染率=（外植體中染菌的數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%，

褐化率=（外植體中褐化的數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%，

萌芽率=（萌芽不污染的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%。

3結果與分析

3.1不同取材時間最佳的滅菌方法

從表1可知，3月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌4～6min，其污染率低于4.4%，但是褐化率達57.8%以上，導致其萌芽率在17.8%以下;3月份取材的半木質化部滅菌4～8min處理，其污染率低于8.9%，但是褐化率達35.6%以上，其萌芽率在44.4%以下。從表2可知，4月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌6～7min最佳，其污染率為4.4%～6.7%，褐化率為6.7%～11.1%，萌芽率達到84.5%～86.7%;4月份取材的半木質化部滅菌10～11min最佳，其污染率為4.4%～13.3%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達到84.5%～88.9%。從表3可知，5月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌8～9min最佳，其污染率為13.3%，褐化率為4.4%～8.9%，萌芽率達到73.3%～82.2%;5月份取材的半木質化部滅菌12～14rain最佳，其污染率為11.1%～15.6%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達到75.6%～82.2%。從表4可知，6月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌10～12min最佳，其污染率為17.8%～24.4%，褐化率為8.9%～13.3%，萌芽率達到42.2%～57.8%;6月份取材的半木質化部滅菌15～16min最佳，其污染率為17.8%～35.6%，褐化率為8.9%～13.3%，萌芽率達到37.8%～57.8%。

3.2不同取材時間對萌芽率的影響

不同取材時間對燦爛莖段外植體的萌芽率影響很大，由表1～4可知，在3月下旬取的莖段，其萌芽率最高才達到44.4%，說明3月份取材不合適;在4～5月份取的莖段，萌芽率為75.6%～88.9%，芽誘導率高，是合適的取材時間;6月上旬取的莖段，萌芽率為55.8%，6月下旬取的莖段，萌芽率降到42.2%以下，說明6月下旬不適合取材。

4結論與討論

4.1結論

兔眼藍莓“燦爛”莖段外植體的取材時間不同，其最適合的滅菌方法也有變化：3月下旬至6月下旬，隨著季節(jié)的推遲，需要逐漸增加0.1%升汞滅菌的時間，才能將污染控制在較低的水平內。

不同取材時間對“燦爛”莖段外植體的腋芽誘導率影響很大，3月下旬取材，腋芽誘導率44.4%以下，4月至6月上旬腋芽誘導率在57.8%以上，6月下旬腋芽誘導率在42.2%以下，因此，“燦爛”最佳的取樣時期是春稍生長期枝條剛開始木質化的4月份，污染率低，誘導效果最好，5月至6月上旬取樣，污染率有所提高，但是萌芽率較高，也能成功建立莖段無菌培養(yǎng)體系，而6月下旬取樣，莖段培養(yǎng)污染率高，腋芽誘導率低，不適合取材。這與涂俊凡等的研究一致。

4.2討論

菌類污染是植物組織培養(yǎng)中較為常見的問題，使用的消毒劑既要能夠把外植體表面的雜菌殺死，又必須容易被無菌水從外植體上沖洗干凈而不至于對外植體本身產生較大的毒害作用進而影響其正常生長。75%酒精滲透力很強，在短時間內便可進入植物細胞行使其毒力作用，所以應用酒精消毒一般是在15～30s之內，即便這樣，也可能會造成外植體一定的死亡率。所以在本試驗中，對外植體嫩部并沒有用酒精進行消毒，在培養(yǎng)過程中的褐化率相對較低。0.1%升汞是組織培養(yǎng)中常用的強消毒劑，具有很強的穿透力和殺傷力，容易殺死和損傷細胞，造成外植體的死亡。因此在使用時，應當控制好消毒的具體時間，既要能殺死表面的雜菌，又不能對外植體造成太大傷害。所以，篩選準確的消毒時間對后續(xù)工作有至關重要的作用。

外植體取材時間對能否成功建立藍莓離體培養(yǎng)體系具有重要影響。在藍莓離體培養(yǎng)芽誘導初期，不同取材時間對誘導芽萌發(fā)的效果不同，這種差異可能來自于植物體內酚類化合物含量和多酚氧化酶活性的季節(jié)性變化。芽萌發(fā)初期，葉片及新梢中酚類物質較少，隨著新梢的生長，酚類物質積累，多酚氧化酶活性增強，取樣外植體易褐化，影響初代培養(yǎng)效果。因此，合適的外植體取材時期是藍莓組培快繁成功與否的關鍵因素之一。