斑馬魚定向篩選在水體化學風險因子鑒別中的應用

王 申 楊方星

(浙江大學環境與資源學院環境健康研究所, 杭州 310058)

水資源是我們生活的重要組成部分, 工業、農業以及人們的日常生活都離不開水。隨著社會的發展和人類活動的加劇, 地球上的水資源受到了不同程度的污染。影響水體安全的因素可以分為物理因素、化學因素、生物因素。而化學因素是研究的熱點內容。當大量人工合成的化學物質進入水體時, 就會對水生生物和人類的健康產生潛在的威脅[1—7]。據報道, 水體污染可以造成魚類甲狀腺干擾效應[8], 也會導致兒童神經系統發育缺陷[1]。

水體的不安全表現為水體對生物的毒性效應,而這些毒性效應是由水體中存在的風險因子產生的, 保障水體安全, 就是要控制其毒性效應, 本質上就是要控制產生這些毒性效應的風險因子。通過以往的研究, 人們已經鑒別出了水體中許多具有毒性效應的化合物, 并建立了受監控化合物庫(就是我們通常說的各種標準里的監測指標), 以此來評價水體的安全性。但是, 僅僅監測這些受監控的化合物并不能夠全面地指示水體的安全, 而且常常忽略可能造成風險的潛在物質。隨著技術手段的發展, 人們能夠檢測的化合物數量越來越多, 濃度也越來越低, 也發現了在現有受監控化合物庫之外的一些化合物具有毒性效應, 能夠影響水體安全。因此, 這些物質也逐漸被加入到受監控的化合物名單中。隨著監控化合物名單變的越來越大, 分析成本也越來越高。因此為了全面地反映水體健康風險的真實情況, 更好的方法是在毒性實驗的基礎上,對水體中的化合物進行全譜檢測, 盡可能多地篩選水體中的風險因子, 來指示水的安全。目前全譜檢測主要的實現途徑就是基于高分辨質譜對樣品中的已知化合物進行定向篩選(Target screening), 對樣品中的未知化合物進行非定向篩選(Non-target screening)[9]。高通量定向篩選是預先設定想要研究的大量化合物, 然后探究樣品中是否存在這些化合物, 而非定向篩選是在沒有預先設定化合物的基礎上, 基于儀器得到的譜圖來推斷樣品中可能存在的化合物[10,11]。非定向篩選由于其缺少化合物的信息, 鑒定物質是相對來說較為困難。

斑馬魚(Zebrafish,Danio rerio)是毒性研究中常用的一種模式生物。它對水質和食物的要求不高,在25—31℃發育正常。斑馬魚因其具有遺傳背景清晰, 體型小, 易于飼養和管理, 發育速度快, 生殖周期短, 繁殖能力強, 胚胎發育快, 胚胎的透光性好等優勢, 被國際經濟合作組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)列為測試的推薦實驗物種, 在環境毒理學中被廣泛應用于神經毒性[12]、生殖毒性[13]、內分泌干擾作用[8,14]等研究。

在本研究中, 我們采集了我國東部某醫藥產業基地河流的水體樣品, 在斑馬魚暴露測試的基礎上,利用高通量定向篩選方法對水樣進行分析, 鑒別樣品中的主要化學因子及其與斑馬魚暴露實驗的相關性, 以此揭示影響該河流中水體安全的主要化學風險因子。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究選擇的河流位于我國東部某省, 該河流所在區域是當地重要的醫藥產業基地。從上游至下游分別設置了7個采樣點, 分別代表了源頭(采樣點1)、農業源支流(采樣點2)、農業源匯流(采樣點3)、工業區下游(采樣點4)、工業區匯流(采樣點5)、生活區下游(采樣點6)、入河口(采樣點7, 該河流在此匯入另一條較大河流)。具體采樣點地址如圖 1所示。水樣的采集參照GB 12998-91中地表水采樣技術指導。每個采樣點取適量河水, 存放在4 L的樣品瓶中, 利用冰袋轉移至實驗室并4℃保存,使用時將其恢復至室溫。

1.2 斑馬魚暴露實驗

模式生物培養斑馬魚購自當地花鳥市場,約4月齡。在暴露實驗前, 斑馬魚飼養在恒溫(26±1)℃且恒光照(光照: 黑暗為14h:10h)的魚房中,在除氯水中馴化5d, 每天喂食豐年蟲1次, 并及時清理食物殘渣和糞便。

暴露實驗實驗設置暴露組和對照組, 對照組用除氯水, 暴露組分別為7個采樣點的河水。每組12條斑馬魚, 暴露在2 L的大燒杯中。暴露時間為8d, 暴露期間, 每天喂食1次, 每2d更換裝置內一半的水, 對照組補充除氯水, 暴露組添加相應的河水。

1.3 高通量定向篩選

標準化合物的配制選取生產生活中常用的醫藥、農藥、獸藥、食品添加劑、表面活性劑、工業原料等248種標準物質作為定向篩選的物質, 其中藥物包括米氮平(Mirtazapine)、氯氮平(Clozapine)、氧氟沙星(Ofloxacin)等; 農藥包括苯銹啶(Fenpropidin)、丁苯嗎啉(Fenpropimorph)、阿特拉津(Atrazine)、異丙甲草胺(Metolachlor)等; 獸藥包括恩諾沙星(Enrofloxacin); 食品添加劑包括抑霉唑(Imazalil)、安賽蜜(Acesulfame)等; 表面活性劑包括月桂酰胺丙基甜菜堿(Lauramidopropyl betaine)等; 工業原料包括對甲苯酰磷酸酯(Tri-p-cresyl phosphate)等。具體成分如附表 1所示。先將各標準物質用純甲醇配制成質量濃度為1 mg/mL的混標溶液(各標準物質的濃度均為1 mg/mL), 然后將混標溶液用甲醇稀釋成100 ng/mL的工作溶液, 利用UPLC/ESI-Q-TOF-MS對該標樣進行分析, 建立定向篩選的分析列表。

水樣的準備將水樣過0.2 μm的水相膜, 進入UPLC/ESI-Q-TOF-MS進行分析。

儀器分析條件樣品的分析使用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜(UPLC/ESI-QTOF-MS, AB Sciex 5600+, 美國)。液相分離色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1 mm×150 mm×1.8 μm,柱溫為25℃。進樣量為10 μL。色譜分離采用水/甲醇(A: 水, B: 甲醇, 均含0.1%甲酸)二元溶劑洗脫, 洗脫梯度為: 0 90%A, 4min 90%A, 26min 0A, 50min 0A, 51min 90%A, 52min 90%A。流速0.2 mL/min。質譜掃描范圍100—1500 amu, ESI正離子模式, 離子源電壓5.5 kv, 離子源溫度600℃。

圖1 各采樣點圖Fig. 1 Map of sampling sites

2 結果與討論

2.1 斑馬魚暴露測試

可以看出, 經過8d的暴露, 各個取水點的斑馬魚均有不同程度的死亡情況(表 1), 而對照組卻全部存活。總的來說, 下游死亡率較上游高。

表1 斑馬魚暴露測試死亡率Tab. 1 Death rates of zebrafish exposed to the river water

2.2 高通量定向篩選列表的建立

首先在軟件中建立含有248種物質名稱和化學式的初始列表, 得到符合一級質譜圖的物質列表,然后打開一種物質的色譜圖, 選中該保留時間下的色譜峰, 觀察有無合理的同位素峰分布以及相應的[M+H+]+峰, 再打開該物質的二級質譜圖, 與結構式圖進行匹配, 記錄下每種物質的匹配率。以異丙甲草胺為例, 過程如圖 2所示。異丙甲草胺帶一個單位正電荷的準分子離子峰的質荷比為284.14118, 而儀器在23.165min時檢測到一個質荷比為284.14146(相對質量誤差為1 ppm, 即百萬分之一)的質譜峰(圖 2a)。再打開保留時間為23.165min時的一級質譜圖, 可以觀察到明顯的[M+H+]+峰及其相應的同位素峰, 還有[M+Na+]+峰及其相應的同位素峰。然后打開該離子峰的二級質譜圖, 并在chemicalbook網站上查找異丙甲草胺的結構式圖, 在軟件中將二者進行關聯后, 軟件會計算出該結構式可能產生的碎片離子, 并與二級質譜產生的峰相匹配, 結果顯示匹配率為100%, 具體匹配結果如圖 2c所示。

將混標溶液用甲醇配制成濃度梯度為100、50、10、5、1、0.5和0.1 ng/mL的標準溶液系列,在相同條件下進行檢測, 計算出其標準曲線方程。在物質鑒定完畢后, 記錄每種物質的保留時間, 即得到定向篩選的分析列表。各物質在其濃度范圍內線性相應較好(絕大部分R2＞0.9, 個別幾種化合物0.85 ＜R2＜ 0.9), 可以用于精確定量。

2.3 水樣的定向篩選

首先打開一個樣品數據, 然后打開建立的定向篩選列表, 軟件會按照列表中物質的一級離子質荷比和相應的保留時間進行篩選, 保留MS誤差在10 ppm以內的物質, 然后進行同位素峰以及二級離子驗證, 并根據標準曲線計算物質的濃度水平。以阿奇霉素為例, 鑒定過程如圖 3所示。阿奇霉素(Azithromycin)標準物質形成的準分子離子質荷比為749.5158, 保留時間為15.77min (圖 3a), 而軟件在15.79min處檢測到一個質荷比剛好為的749.5158的離子峰(圖 3b)。該離子峰可能為阿奇霉素形成的準分子離子峰。然后觀察到質荷比為749.5158的離子峰存在明顯的同位素峰, 其[M+H+]+峰也存在明顯的同位素峰(圖 3c)。接著打開該離子峰下的二級質譜圖, 并在chemicalbook網站上查找該物質的結構式圖, 在軟件中將二者進行關聯后, 結果顯示二級質譜的匹配率為100%, 具體匹配結果如圖 3d。

各采樣點檢測到的物質及濃度如表 2所示。在該河流中共鑒別出24種化合物, 但各采樣點檢出的化合物數量并不一致, 采樣點1—7分別檢出24、24、24、21、21、21和20種化合物。檢出的化合物以藥物為主, 其中包含了17種藥物, 如米氮平、地氯雷他定等。這可能是由于當地有許多醫藥企業, 藥物組分通過污水排放、大氣沉降等各種途徑進入河流后殘留在水體中。此外, 檢出化合物的濃度從上游到下游基本呈現出減小的趨勢,可能是由于該河流在向下游流動的過程中, 有多個小支流匯入, 導致徑流量增大, 從而起到了一定的稀釋作用。

2.4 水體風險因子鑒別

將各個水樣中所檢出的24種化合物的濃度與暴露實驗中斑馬魚的死亡率分別進行關聯, 并用origin軟件進行線性擬合, 記錄其線性方程y=a+bx中的斜率b, 相關系數R2以及顯著性分析P(表 3)。

在定向篩選中鑒定出來的24個化合物的濃度與斑馬魚死亡率均不呈正相關, 因此我們認為, 河水中檢出的化合物可能不是造成斑馬魚死亡的主要原因。此外, 由于缺乏檢出化合物對斑馬魚的毒性數據, 無法定量評價檢出化合物對斑馬魚死亡的毒性貢獻。

3 總結

我國東部某醫藥產業基地河流水樣對斑馬魚進行暴露實驗后, 斑馬魚出現有不同程度的死亡。高通量定向篩選鑒定出了水樣中以藥物成分為主的24種化合物, 但這些化合物的濃度水平無法完全解釋斑馬魚暴露實驗的結果。因此, 我們推斷, 鑒定出的藥物組成不是該河流水體健康風險的主要因子。

本研究主要考慮水體中極性有機污染物對斑馬魚的毒性效應, 并未考慮水體的理化參數, 比如溶解氧等以及其他無機污染物, 如重金屬等的毒性貢獻。在接下來的研究中, 可以考慮對水樣的理化參數以及水樣中的金屬離子含量進行檢測,也可以利用非定向分析對樣品中的化合物進行解析, 以進一步揭示該河流中造成斑馬魚死亡的主要毒性因素。

圖2 混合標樣中異丙甲草胺的鑒定Fig. 2 Identification of metolachlor in standard mixture

圖3 水樣中阿奇霉素的鑒定Fig. 3 Identification of azithromycin in water sample

表2 水體樣品中鑒定出的化合物Tab. 2 Compounds identified in the river water

表3 水樣中檢出的24種化合物濃度與斑馬魚死亡率的相關性Tab. 3 The relationship between the concentrations of all compounds detected in the water samples with the death rates of zebrafish in the exposure experiment

續表 3

附表 1 定向篩選化合物Attached Tab. 1 Compounds involving target screening

續附表1

續附表1