西昌華吸鰍的微衛星引物篩選及赤水河四個地理種群的遺傳多樣性分析

張 智 俞 丹 劉 飛 劉煥章

(1. 中國科學院水生生物研究所水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

西昌華吸鰍(Sinogastromyzon sichangensis)隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 爬鰍科(Balitoridae), 華吸鰍屬(Sinogastromyzon), 是長江上游特有的一種小型魚類, 主要分布于長江上游干流及部分支流[1]。赤水河為長江右岸一級支流, 流經滇、川、黔, 于四川省合江縣匯入長江, 全長466 km。西昌華吸鰍是赤水河上、中游及部分支流的常見種[2], 喜急流環境, 利用腹鰭愈合成的吸盤棲息于溪流的砂石上[3]。目前, 關于西昌華吸鰍的研究報道較少, 早期多見于生物學研究[4—6]及保護生物學研究[7—10]。近年來,隨著分子生物學的發展, 相關類群的系統發育研究逐漸展開[11—13], 李小娟[14]基于線粒體Cytb及核基因(EGR2、BIRBP、Zic1)對華吸鰍屬魚類物種分化進行了研究。但是西昌華吸鰍的種群遺傳學研究仍然缺乏。

微衛星DNA標記由于具有共顯性、高度遺傳多態性和等位基因分型難度低等優點, 得到了廣泛的應用, 而高多態性的微衛星位點也已成為種群遺傳學研究的普遍選擇[15]。本研究利用高通量測序技術共篩選出西昌華吸鰍29對具有多態性的微衛星引物, 并利用其中20對引物對赤水河4個地理種群的遺傳多樣性、種群分化及遺傳結構進行分析,為長江上游特有魚類的保護積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與總DNA提取

2016年5月至9月分別于赤水河源頭云南水田鎮(ST), 上游四川赤水鎮(CSZ), 中游貴州茅臺鎮(MT)及赤水河支流習水河官渡鎮(XS)河段采集西昌華吸鰍樣本(圖 1), 每個地點各取30尾西昌華吸鰍剪取背部肌肉固定于95%乙醇溶液, 保存于中國科學院水生生物研究所淡水魚類博物館。基因組DNA的提取采用高鹽抽提法[16], 并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量, 置于-20℃保存備用。

1.2 高通量測序、微衛星位點挖掘及篩選

使用Illumina Miseq測序儀對西昌華吸鰍一個個體的基因組DNA進行全基因組測序, 過濾掉接頭、低質量序列后先進行基因組組裝, 之后通過MISA軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對微衛星位點進行搜索。選取重復類型三堿基或四堿基, 重復次數大于5且長度在70—500 bp的片段進行引物開發, 引物設計在NCBI的Primer-BLAST網頁(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線完成[17]。

隨機選取8尾西昌華吸鰍個體的基因組DNA尾模板對設計的引物進行篩選并優化反應條件。PCR反應體系包括100 ng模板DNA, 10 μL 2×Master Mix (TSKINGKE), 上下游引物各1 μL并用滅菌水補充至20 μL總體系。PCR反應程序為: 95℃預變性5min; 95℃變性30s, Tm退火30s (表 1), 72℃延伸45s, 以上程序30個循環重復; 最后72℃延伸5min。反應產物采用30%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測, 經Ultra GelRed (Vazyme) 水溶液浸染后,在GeneSnap (Syngene) 紫外成像系統下拍照保存。

1.3 種群擴增與讀帶

選取20對多態性引物, 對赤水河4個不同地理種群的西昌華吸鰍進行擴增, 反應體系和程序同上, 利用pBR322DNA/MspⅠ和pUC18DNA/MspⅠ (Tiangen)為參照以確定不同位點等位基因大小。利用GeneSnap凝膠成像系統自動標記擴增的PCR片段并輔以人工校正, 與pBR及pUC進行比較, 最后讀取不同等位基因大小。

1.4 數據處理與分析

原始數據通過CONVERT 1.31軟件轉化為各軟件所需格式[18]。利用MICRO-CHECKER軟件檢查有無出現等位基因缺失、無效等位基因 (Null allele)或者由于結巴帶(Shutter)引起的錯配等情況[19]。通過GENEPOP檢驗微衛星位點是否符合哈迪溫伯格平衡[20]。利用Cervus 3.03軟件計算幾個不同地理種群西昌華吸鰍的等位基因數(Number of alleles,Na)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、多態信息含量(Polymorphic information content,PIC)[21]。利用Arlequin3.5軟件估算幾個種群的遺傳分化指數(Fst)并進行分子變異分析方法(AMOVA)分析[22]。通過Structure軟件對西昌華吸鰍種群結構進行分析[23, 24]。

圖1 赤水河流域采樣圖Fig. 1 Sampling sites in Chishui River

2 結果

2.1 微衛星標記篩選

高通量測序共獲得34401條存在微衛星位點的序列。在檢出的微衛星序列中, 二核苷酸占優勢,占全部微衛星序列的51.50%; 三核苷酸次之, 占總序列的34.54%; 其次是四核苷酸, 為6.46%; 五、六核苷酸最少, 合計占總序列的7.50%。根據微衛星位點篩選要求和引物設計原則, 共設計144對引物,其中52對引物成功擴增, 但只有29對引物顯示了較高的多態性, 引物基本信息詳見表 1。

表1 西昌華吸鰍微衛星位點及PCR引物信息Tab. 1 Information of polymorphic microsatellite markers of S. sichangensis

2.2 種群遺傳多樣性及遺傳分化

選取20對多態性較高的引物對西昌華吸鰍4個地理種群進行擴增, 種群遺傳多樣性結果如表 2所示。西昌華吸鰍四個地理種群的等位基因數在7—28; 赤水鎮種群平均觀測雜合度最高, 為0.669;水田鎮種群的期望雜合度最高, 為0.890; 茅臺鎮種群觀測雜合度和期望雜合度最低, 分別為0.520和0.867; 習水河種群平均多態信息含量最高為0.868。4個種群分別有2到8個位點偏離哈迪溫伯格平衡,所有地理種群西昌華吸鰍的平均多態信息含量均大于0.86, 表明西昌華吸鰍幾個種群的遺傳多樣性處于較高水平。

表2 西昌華吸鰍4個種群微衛星標記的遺傳學特征Tab. 2 Characteristics of the 20 microsatellite loci in 4 populations of S. sichangensis

對西昌華吸鰍4個地理種群進行遺傳分化指數計算并進行顯著性檢驗(表 3), 結果顯示, 水田鎮、赤水鎮、茅臺鎮三個種群間無顯著分化, 而習水河種群與其他3個種群均存在顯著差異(Fst全部大于0.25,P＜0.01)。分子方差分析顯示(表 4), 遺傳變異主要來源于群體內(96.67%), 群體間的遺傳變異僅為3.33%。

表3 西昌華吸鰍4個種群間的遺傳分化系數Tab. 3 Pairwise Fst estimates 4 populations of S. sichangensis

表4 赤水河西昌華吸鰍分子變異分析Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for S.sichangensis

2.3 種群遺傳結構

利用Structure軟件進行種群結構分析, 計算得出K=2是比較理想的種群亞型類群數目, 即4個種群120尾西昌華吸鰍個體可分為兩個亞類群, 如圖 2所示, 不同灰度分別代表不同的亞類群, 其中水田鎮、赤水鎮及茅臺鎮種群的遺傳背景整體趨于一致, 而習水河種群則單獨聚于另外一個亞類群, 與遺傳分化分析結果相一致。

3 討論

3.1 微衛星引物篩選

傳統的微衛星分離技術包括小片段DNA克隆法和微衛星富集文庫法[25]。隨著二代測序技術的發展, 具有通量大、成本低、周期短特點的高通量測序對基因組進行隨機測序即可獲得大量的微衛星序列, 相比傳統方法在獲取微衛星序列方面展現出了突出的優勢[26,27]。特別是對于西昌華吸鰍這類DNA序列數據較為貧乏的物種, 利用高通量測序獲取微衛星序列的技術難度減小且效率大幅提高。因此, 高通量測序法必將逐步取代傳統方法,成為微衛星標記開發領域的主流。

圖2 西昌華吸鰍種群結構分析Fig. 2 Population structure of S. sichangensis

3.2 西昌華吸鰍種群遺傳學特征

生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性, 其中遺傳多樣性既是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎, 也是生物多樣性的核心和重要組成部分。雜合度是描述群體遺傳學上的群體多態性, 當雜合度在0.5到0.8之間即可認為該群體具有較高的多樣性[28]。在本研究中, 西昌華吸鰍在赤水河及其支流的4個種群的觀測雜合度值均大于0.5, 表明各種群遺傳多樣性現狀均處于較高水平。多態信息含量也是衡量基因片段多態性的理想指標, Botstein等[29]認為當PIC＞0.5時, 該位點即為高度多態位點。本實驗中各種群PIC均大于0.5, 表明西昌華吸鰍各種群遺傳多樣性高, 說明這些種群種質資源良好, 具有一定的種群穩定性。

3.3 西昌華吸鰍種群分化與遺傳特征

遺傳分化指數Fst是揭示種群間遺傳分化程度的重要參數。Wright[30]認為: 若種群間Fst＜0.05, 則表明種群間無分化; 若0.05＜Fst＜0.15, 則表明種群間存在中度分化; 若0.15＜Fst＜0.25, 則為高度分化。在本研究中, 赤水河干流水田、赤水鎮、茅臺種群間遺傳分化指數均小于0.05, 表明干流種群間無顯著分化; 而習水河種群與干流種群Fst均大于0.25, 存在高度分化。種群遺傳結構分析結果同樣與上述結果一致, 習水河種群單獨聚為一個亞類群, 而干流種群遺傳背景趨于一致, 聚為另一個亞類群。

西昌華吸鰍與四川華吸鰍相似, 產微黏性卵,在自然條件下常黏附于河流激流礫石灘上完成胚胎發育過程, 由于黏性較弱, 受水流沖擊后常脫離基質順水漂流[31]。習水河與赤水河交匯于赤水河下游近河口處, 與赤水河上游和中游種群難以進行基因交流, 進而逐漸分化成獨立的亞群。

西昌華吸鰍是我國長江上游地區的特有類群, 具有重要的遺傳價值和生態價值。近年來野外調查也發現西昌華吸鰍的種群規模呈下降趨勢。因此, 在今后的管理中仍應加大赤水河水質的保護力度, 為長江上游特有水生生物資源提供良好的棲息環境。

致謝：

感謝中國科學院水生生物研究所王雪、張富斌、秦強在野外采樣給予的幫助。