甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺物中miRNA-221和miRNA-125的表達(dá)及意義*

張雙元,梅士娟,孔令達(dá),張晨如,措 羊,張易青,馬淑梅

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科二科，西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系,西寧 810001;3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,西寧 810001;4.青海大學(xué)附屬醫(yī)院超聲科,西寧 810001)

隨著超聲檢查的普及和診斷技術(shù)的提高，甲狀腺結(jié)節(jié)成為最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病和臨床難題[1-2]。如何在術(shù)前快速、有效地明確甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性困擾著外科醫(yī)生。細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查(fine-needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB)是術(shù)前評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)靈敏度、特異度最高的方法[3-4]，但仍有20%～30%的病例不能明確診斷[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中miRNAs表達(dá)紊亂[6]，本文選擇FNAB后良惡性未能明確的甲狀腺結(jié)節(jié)患者，檢測(cè)穿刺物中miRNA-221、miRNA-125的表達(dá)量，研究其與甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性診斷的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年6月至2018年8月青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科二科收治的138例經(jīng)FNAB后良惡性不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)甲狀腺結(jié)節(jié)經(jīng)超聲引導(dǎo)下FNAB提示甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)中Ⅲ類或Ⅳ類；(2)穿刺物足夠檢測(cè)2種微小核糖核酸；(3)無(wú)其他腫瘤性疾病；(4)全身麻醉下進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)切除手術(shù)；(5)組織病理學(xué)資料及病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)凝血功能障礙；(2)細(xì)胞學(xué)診斷考慮甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)中Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅵ類；(3)伴有其他腫瘤性疾病；(4)穿刺物不能滿足檢測(cè)2種微小核糖核酸；(5)未進(jìn)行手術(shù)，組織病理學(xué)資料不完整；(6)病歷資料不完整。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 RNA保存溶劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：15596026)，總RNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit(德國(guó)QIAGEN公司，貨號(hào)：217004)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan MicroRNA(美國(guó)ABI公司，貨號(hào)：4366596)，熒光定量PCR擴(kuò)增試劑盒TaqManTMUniversal Master Mix II,no UNG(美國(guó)ABI公司，貨號(hào)：4440043)，Mastercycler?ep realplex型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)，miRNAa定量擴(kuò)增試劑盒TaqMan?MicroRNA assays(美國(guó)ABI公司)，無(wú)RNA酶、無(wú)DNA酶、無(wú)熱源的槍頭、離心管等(美國(guó)Axygen公司)。

1.3方法

1.3.1穿刺物 2%利多卡因局部麻醉下進(jìn)行穿刺操作。在實(shí)時(shí)超聲引導(dǎo)下采用細(xì)針(22～25G)進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺，顯示針尖在實(shí)性病灶內(nèi)后重復(fù)提插數(shù)次完成取材，每個(gè)結(jié)節(jié)穿刺2～3次。拔出穿刺針后，立即將細(xì)針穿刺物涂于載玻片上制作薄層涂片2張，固定，送細(xì)胞學(xué)檢查。剩余穿刺物直接置入RNA保存溶劑 Trizol中保存，放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.2檢測(cè)miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá) 按照文獻(xiàn)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺物進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣本均應(yīng)用TaqMan熒光探針檢測(cè)miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)量。

1.3.3病理學(xué)診斷 在氣管插管全身麻醉下施行手術(shù)。患者仰臥、取頸部過(guò)伸位。先進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)切除手術(shù)，根據(jù)術(shù)中冰凍病理診斷結(jié)果確定原發(fā)病灶手術(shù)范圍：?jiǎn)蝹?cè)甲狀腺腺葉次全切除術(shù)、單側(cè)甲狀腺腺葉切除術(shù)或全甲狀腺切除術(shù)。病理科醫(yī)生將手術(shù)切除的甲狀腺結(jié)節(jié)制作成石蠟切片：包括取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟、染色、封片等步驟。兩名副主任醫(yī)師以上職稱的病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷。其中良性甲狀腺結(jié)節(jié)94例，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)44例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，采用Mann-whitney秩和檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p在甲狀腺結(jié)節(jié)中的表達(dá) miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)在惡性組中相對(duì)于良性組均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)量[M(Q25,Q75)]

2.2miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度 miRNA-221-3p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的CUT-OFF值為1.445 0，miRNA-221-3p表達(dá)量低于1.445 0認(rèn)為是良性結(jié)果，高于1.445 0則認(rèn)為是惡性結(jié)果，靈敏度為0.864，特異度為0.745，約登指數(shù)為0.609，AUC為0.804，見(jiàn)表2、圖1。miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的CUT-OFF值為1.845 0，miRNA-125b-5p表達(dá)量低于1.845 0認(rèn)為是良性結(jié)果，高于1.845 0則認(rèn)為是惡性結(jié)果，靈敏度為0.750，特異度為0.777，約登指數(shù)為0.527，AUC為0.763，見(jiàn)表3、圖2。

表2 miRNA-221-3p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度(n)

圖1 miRNA-221-3p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的ROC曲線

表3 miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度(n)

圖2 miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的ROC曲線

2.3miRNA-221-3p聯(lián)合miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度 聯(lián)合檢測(cè)miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p進(jìn)行診斷，即miRNA-221-3p表達(dá)量高于1.445 0且miRNA-125b-5p表達(dá)量高于1.845 0，甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性。靈敏度為0.705，特異度為0.904，約登指數(shù)為0.609，AUC為0.804，見(jiàn)表4、圖3。

表4 miRNA-221-3p聯(lián)合miRNA-125b-5p診斷惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度(n)

圖3 miRNA-221-3p聯(lián)合miRNA-125b-5p

3 討 論

FNAB是甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)前最精準(zhǔn)的病理診斷方式，靈敏度89%～98%,特異度92%[7],用于術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的性質(zhì)。診斷標(biāo)準(zhǔn)采用甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)。FNAB后仍有20%～30%不能明確診斷。FNAB診斷不明確甲狀腺結(jié)節(jié)是指甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda評(píng)分系統(tǒng)中Ⅲ類意義不明確的細(xì)胞非典型性病變或意義不明確的濾泡性病變及Ⅳ類濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤。因存在惡性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于這部分甲狀腺結(jié)節(jié)，臨床醫(yī)生均會(huì)建議患者進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)切除手術(shù)。然而，手術(shù)切除的甲狀腺病變經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)84%為良性[8]。因此，臨床需要新的診斷技術(shù)提高FNAB后良惡性診斷不明確甲狀腺結(jié)節(jié)的確診率，從而減少未明確甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性而進(jìn)行的診斷性甲狀腺切除手術(shù)。高分辨率超聲能夠確定甲狀腺結(jié)節(jié)的囊實(shí)性質(zhì)、個(gè)數(shù)、大小、縱橫比、硬度、包膜是否完整、有無(wú)血流信號(hào)及淋巴結(jié)的狀態(tài)。本文甲狀腺結(jié)節(jié)FNAB在超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下進(jìn)行。對(duì)于囊實(shí)性甲狀腺結(jié)節(jié)，依靠觸診引導(dǎo)進(jìn)行的穿刺檢查不能準(zhǔn)確刺入實(shí)性部分，獲得的細(xì)胞數(shù)目少，診斷價(jià)值不高；而超聲引導(dǎo)下甲狀腺結(jié)節(jié)FNAB使穿刺目標(biāo)更為準(zhǔn)確，提高囊實(shí)性病變實(shí)性部分的取材成功率，同時(shí)有利于穿刺過(guò)程中對(duì)重要組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)、判斷穿刺后有無(wú)血腫。與觸摸甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺相比，超聲引導(dǎo)下能獲得更好的代表性樣本，診斷準(zhǔn)確率高[9]。

近年來(lái)，采用細(xì)針穿刺獲取物檢測(cè)分子標(biāo)記物進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)診斷取得了很大進(jìn)步。已有研究顯示[10-12]，分析BRAF、RAS、TERT、TP53等基因的突變可預(yù)測(cè)甲狀腺惡性病變。但2015版甲狀腺癌ATA指南并未推薦用于細(xì)針穿刺后未能明確良惡性的甲狀腺結(jié)節(jié)患者[3]。miRNA是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的非編碼小分子RNA，廣泛存在于脊椎動(dòng)物、果蠅、線蟲(chóng)等各種生物中，具有高度保守性。CASTAGNA等[13]分析了甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺物中11種微小核糖核酸的表達(dá),認(rèn)為miRNA146b、miRNA-221、miRNA-222在惡性或可疑惡性甲狀腺結(jié)節(jié)中的表達(dá)高于良性甲狀腺結(jié)節(jié)。DETTMER等[14]應(yīng)用miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在濾泡狀甲狀腺癌(FTC)腫瘤組織中miR-182/-183/-221/-222/-125a-3p的表達(dá)增加，miR542-5p/-574-3p/-455/-199a 的表達(dá)下降。AGRETTI等[15]報(bào)道,miR-30d、miR-125b、miR-26a、miR-30a5p 在未分化甲狀腺(ATC)組織中的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照甲狀腺組織，miR-146b、miR-221、miR-222 在 ATC 組織中的表達(dá)明顯高于多結(jié)節(jié)甲狀腺腫組織，且 miR-221 和 miR-222 在石蠟包埋 PTCs、FTCs、ATCs 等甲狀腺腫瘤組織中明顯高表達(dá)。因此，了解甲狀腺癌中特異性 miRNAs 表達(dá)譜的變化，有望應(yīng)用于甲狀腺癌的診斷、高危人群的普查、 腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221-3p良性組表達(dá)量為0.825，惡性組表達(dá)量為4.305； miRNA-125b-5p良性組表達(dá)量為1.085，惡性組表達(dá)量為2.690。惡性組中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)量相對(duì)于良性組均明顯上調(diào)。miRNA-221-3p診斷的靈敏度0.864，特異度0.745；miRNA-125b-5p診斷的靈敏度0.750，特異度0.777；miRNA-221-3p聯(lián)合miRNA-125b-5p診斷時(shí)靈敏度0.705，特異度0.904。這提示甲狀腺結(jié)節(jié)患者在FNAB后不能判定良惡性的情況下，進(jìn)一步檢測(cè)miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)量有助于評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，減少不必要的診斷性甲狀腺手術(shù)，可以避免患者額外承受的病痛，有利于減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

本研究的不足：(1)研究的微小核糖核酸的種類少，增加種類是否有助于確定甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性有待于進(jìn)一步研究；(2)細(xì)針穿刺物中miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p檢測(cè)與患者的病理學(xué)特征結(jié)合是否能夠進(jìn)一步提高術(shù)前評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性有待于下一步研究；(3)研究病例數(shù)少，診斷甲狀腺結(jié)節(jié)惡性的閾值需進(jìn)一步確定。

綜上所述，在FNAB不能確定甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性時(shí)，進(jìn)一步檢測(cè)miRNA-221-3p、miRNA125b-5p的表達(dá)量有助于臨床醫(yī)生評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性，減少不必要的診斷性甲狀腺手術(shù)。但miRNA-221-3p、miRNA-125b-5p的表達(dá)量達(dá)到多少閾值具有更佳的靈敏度和特異度需要增大病例數(shù)進(jìn)一步研究。