院內耐阿米卡星肺炎克雷伯菌β-內酰胺類耐藥基因的研究*

姜梅杰,張志軍,劉麗娟,李 琳

(1.山東省泰安市中心醫院檢驗科 271000；2.山東省濟南市人民醫院檢驗科 271100;3.山東省泰安市中心醫院感染管理科 271000)

多重耐藥肺炎克雷伯菌已是院內感染重要病原菌之一。中國CHINET細菌耐藥性監測發現，近年來肺炎克雷伯菌分離率一直位居第二位，對阿米卡星耐藥率為9.0%～12.6%[1-6]。β-內酰胺類等是臨床治療肺炎克雷伯菌引起感染的常用抗菌藥物。但近年來,由于臨床分離的肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類、碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率迅速增加，已給臨床治療肺炎克雷伯菌引起的感染帶來了巨大的困難。為尋找肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的原因，防止院內多重耐藥肺炎克雷伯菌的暴發流行。本研究對阿米卡星耐藥的肺炎克雷伯菌進行同源性及β-內酰胺類相關耐藥基因研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1菌株來源 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌來源于2013年6月至2014年11月泰安市中心醫院(醫院1)和山東省立醫院(醫院2)臨床分離的標本中,其中醫院1為22株(菌株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23)、醫院2為5株(菌株14、24、25、26、27)。14株標本來自患者的痰液，10株標本來自患者的尿液，3株標本來自患者的穿刺液。

1.2方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏試驗 細菌鑒定及藥敏試驗采用WalkAway 96 PLUS微生物全自動分析儀。部分抗菌藥物的敏感性采用紙片擴散法和E-test法。

1.2.2同源性分析 參照美國CDC(PulseNet USA，2002)制訂的對大腸桿菌節進行脈沖場凝膠電泳的統一方法設計實驗。同源性分析采用脈沖場電泳(PFGE)法,將PFGE圖像錄入BioNumerics(Version 5.1,Appliedmaths,Inc.)軟件包進行處理,識別圖像條帶,經統一的分子質量標準進行校準(沙門菌H9812),標定條帶位置,必要時進行手工校正本分析，以80%同源性作為臨界值來分型。

1.2.3耐藥基因檢測 β-內酰胺酶基因引物參照文獻[7-9]，均為PCR法。NDM-1基因PCR擴增引物序列參照中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所公布的引物序列。

1.2.4DNA測序 對部分陽性基因進行測序，PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序，測序結果在GenBank網上查詢。

1.3統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，菌株信息和藥敏結果錄入WHONET5．6軟件。

2 結 果

2.1抗菌藥物敏感試驗情況 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南、厄他培南、哌拉西林/他唑巴坦、復方新諾明、頭孢吡肟、頭孢西丁、氧氟沙星、環丙沙星、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率分別為25.93%、25.93%、25.93%、51.85%、77.78%、85.19%、85.19%、85.19%、85.19%、92.59%。

2.2肺炎克雷伯菌PFGE檢測情況 PFGE顯示 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌分為14種譜型，見圖1。主要為E譜型(22.22%)，其次為D譜型(11.11%)、H譜型(11.11%)和M譜型(11.11%)，其余譜型1～2株。菌株14、18、20、21、22、25同源性100% 為E譜型,E譜型在2家醫院存在克隆流行株。

圖1 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌PFGE 分型情況

圖2 CTX-M3群基因PCR產物部分電泳圖

2.3β-內酰胺類耐測基因檢測及測序情況 27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，100%(27/27)的β-內酰胺酶基因陽性。9株CTX-M3群基因陽性，檢出率為33.33%，見圖2；14株CTX-M1群基因陽性，檢出率為51.85%；6株KPC基因陽性，檢出率為22.22%；1株NDM-1基因陽性，檢出率為3.70%，見圖3；14株DHA基因陽性，檢出率為51.85%；23株SHV基因陽性，檢出率為85.19%；27株TEM基因都陽性，檢出率為100.00%。分別對不同譜型的CTX-M3群陽性基因、CTX-M1群陽性基因、KPC陽性基因、SHV陽性基因、DHA陽性基因、TEM陽性基因進行測序，經分析6株(22.22%)為CTX-M-15型超廣譜β-內酰胺酶基因、3株(11.11%)為CTX-M-3型超廣譜β-內酰胺酶基因、4株(14.81%)為CTX-M-14型超廣譜β-內酰胺酶基因、10株(37.03%)為CTX-M-65型超廣譜β-內酰胺酶基因、6株(22.22%)為KPC-2型碳青霉烯酶基因、11株(40.74%)為SHV-12型超廣譜β-內酰胺酶基因(圖4)、3株(11.11%)為SHV-1型廣譜β-內酰胺酶基因、9株(33.33%)為SHV-11型非超廣譜β-內酰胺酶基因、14株(51.85%)為DHA-1型頭孢菌素酶基因、27株為TEM基因TEM-1型廣譜β-內酰胺酶基因、1株為NDM-1金屬β-內酰胺酶基因。β-內酰胺類陽性耐藥基因的分布情況及β-內酰胺類抗菌藥物敏感性試驗檢測結果見表1。

圖3 NDM-1基因PCR產物部分電泳圖

圖4 SHV-12基因測序圖

表1 27株β-內酰胺類陽性基因的分布情況及β-內酰胺類抗菌藥物敏感性試驗檢測情況

續表1 27株β-內酰胺類陽性基因的分布情況及β-內酰胺類抗菌藥物敏感性試驗檢測情況

+：β-內酰胺酶基因陽性；-：β-內酰胺酶基因陰性；S：敏感；R：耐藥

3 討 論

肺炎克雷伯菌已是院內感染重要病原菌之一。細菌耐藥監測結果顯示,2013-2016年泰安市中心醫院肺炎克雷伯菌對阿米卡星耐藥率為4.5%～7.3%，但耐藥性嚴重。呂爽等[10]報道的吉林大學中日聯誼醫院2013-2015年每年臨床分離的肺炎克雷伯菌對阿米卡星耐藥率均小于5.5%，低于泰安市中心醫院2013-2015年每年臨床分離的肺炎克雷伯菌對阿米卡星耐藥率。說明不同醫院同一時間段臨床分離的肺炎克雷伯菌對阿米卡星的耐藥率不完全相同。

本研究的27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，有22株來源于醫院1，其余5株來源于醫院2。研究發現菌株14、18、20、21、22、25同源性100%為E譜型，其中菌株14、25來源于醫院2，菌株18、20、21、22來源于醫院1，說明2家醫院存在相同的E譜型克隆株。醫院1的重癥患者經常轉入醫院2進行治療，本研究中的醫院2患者與醫院1患者感染的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌存在同源性100%菌株，究其原因將繼續研究。警示醫院感染控制管理部門不僅應關注院內，同時也應關注醫院間耐藥菌的傳播流行。

歷年CHINET細菌耐藥性監測數據顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%上升到了2017年的20.9%、24.0%，與此同時，肺炎克雷伯菌每年的分離率亦呈穩步上升趨勢[1-6]。產碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制，包括A、B、D 3類[11]。KPC-2為A類碳青霉烯酶，NDM-1為金屬β-內酰胺酶。2001年YIGIT等[12]在美國報道了產KPC-1型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌；隨后其他地區相續發現了產KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌[13-17]。有研究表明，產碳青霉烯酶類藥物水解酶KPC-2是導致華東地區克雷伯菌屬對碳青霉烯類耐藥的重要原因之一[18]。攜帶有blakpc-2的細菌對包括碳青霉烯類在內的所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥[19]。本研究27株耐阿米卡星肺炎克雷伯菌中，有6株產KPC-2型碳青霉烯酶、1株產NDM-1金屬酶,這7株菌對亞胺培南、美羅培南和厄他培南等β-內酰胺類抗菌藥物均耐藥,其余20株對亞胺培南、美羅培南和厄他培南均敏感的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌未檢測出碳青霉烯酶，說明KPC-2型碳青霉烯酶和NDM-1金屬酶是引起亞胺培南、美羅培南和厄他培南耐藥的重要因素之一。研究顯示，產NDM-1酶菌株在易于通過質粒不同細菌之間進行水平傳播，應引起重視并加強監控，以避免其在臨床菌株中的快速擴散[20]。

有4株產DHA-1頭孢菌素酶基因，未檢出超廣譜β-內酰胺酶基因和碳青霉烯酶基因的耐阿米卡星肺炎克雷伯菌對四代頭孢菌素(頭孢吡肟)和碳青霉烯酶類抗菌藥物(亞胺培南、美羅培南、厄他培南)敏感，對一代頭孢菌素(頭孢唑啉)、二代頭孢菌素(頭孢夫新)和三代頭孢菌素(頭孢噻肟、頭孢他定)耐藥,說明產DHA-1頭孢菌素酶的肺炎克雷伯菌對一代、二代、三代頭孢菌素均耐藥,對四代頭孢菌素和碳青霉烯酶類抗菌藥物敏感。ESBLs是由質粒介導產生的水解酶類，能水解超廣譜頭孢菌素類、青霉素類及氨曲南等[21]。本研究20株檢出CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶基因中，有3株同時攜帶2種CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶基因、10株同時攜帶SHV-12型超廣譜β-內酰胺酶基因、6株同時攜帶KPC-2型碳青霉烯酶基因，說明了耐阿米卡星肺炎克雷伯菌對頭孢菌素類抗菌藥物耐藥是多種β-內酰胺類耐藥基因參與造成的。

綜上所述，耐阿米卡星肺炎克雷伯菌耐藥嚴重，在2家醫院發現相同的克隆株,醫院感染控制部門應密切監控醫院內和醫院間耐藥菌的傳播。具體播散機制和臨床治療方案有待進一步研究。