枸杞多糖對離心過程中弱精精子氧化應(yīng)激的作用研究*

顏 貝，王佳陪，王 娟，王紅燕，周 岳，田 稼，馬良宏△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精子庫，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)銀川市婦幼保健院 750001；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)病理系，銀川 750001)

活性氧(ROS)是氧的代謝產(chǎn)物，過高濃度的ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞的脂類、蛋白和DNA氧化，從而引起一系列的病理變化。ROS的氧化損傷導(dǎo)致精子活力下降，影響男性生育力。而在輔助生殖技術(shù)助孕過程中，處理患者精子時離心會引發(fā)ROS過量產(chǎn)生，加之抗氧化物質(zhì)在處理過程嚴(yán)重丟失，更容易過氧化而損傷精子功能和活力。減少處理精子過程中產(chǎn)生的ROS，對患者助孕的成功率，尤其對弱精癥患者有重要意義。藥單體枸杞多糖作為中藥枸杞子最珍貴的提取物，含有多種氨基酸和微量元素的蛋白質(zhì)多糖，富含鋅、硒、錳等微量元素。大量研究表明，枸杞多糖具有明顯的清除氧自由基、抗氧化損傷、抗細(xì)胞凋亡、保護生殖系統(tǒng)的作用[1-3]。本研究探討枸杞多糖在精液體外離心過程中對于精子氧化應(yīng)激的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月1日至2017年10月1日在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心門診就診的弱精癥患者32例為研究對象，年齡25～35歲，已婚未育,身體健康，無吸煙、酗酒和長期接觸有害物質(zhì)史，無生殖道感染和精索靜脈曲張史、外傷、遺傳性疾病史、性功能障礙史等，體檢顯示一般情況好，全身及男性生殖系統(tǒng)檢查未見異常。按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(2011年第五版) 標(biāo)準(zhǔn)，精液體積大于或等于1.5 mL，精子總數(shù)大于或等于39×106/mL,前向運動精子百分率(PR)<32%，精子(PR+NP)≤40%。排除液化不良、嚴(yán)重少弱精癥、白細(xì)胞精子癥(過氧化物酶陽性白細(xì)胞小于1.0×106/mL)。本課題經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2016049)，患者知情同意。

1.2方法

1.2.1分組與處理 標(biāo)本處理及檢測在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心門診實驗室及寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室進行。患者精液標(biāo)本置于37 ℃水浴搖床液化30 min，充分搖勻后每份標(biāo)本各吸取1 200 μL平均分為3份，每份400 μL，分為空白對照組、離心組和枸杞多糖組。對照組和離心組各加入100 μL Hanks′平衡液，枸杞多糖組加入100 μL含有一定濃度枸杞多糖的Hanks′液。所有標(biāo)本放入37 ℃水浴搖床20 min；除空白對照組外，另外兩組500 g離心10 min后用移液器輕吹混勻待檢。

1.2.2精子相關(guān)參數(shù)檢測 相差顯微鏡下采用marker計數(shù)板檢測精子活力，計數(shù)10個小格；重復(fù)檢測2次，若不在可接受誤差之內(nèi)重新取樣再次評估。精子存活率實驗：采用《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》(2011年第五版)推薦的伊紅-苯胺黑存活率實驗檢測法檢測。每個標(biāo)本重復(fù)評估2次，評估200個精子，以達到可接受的低抽樣誤差。如果差異太大，重新2次精液取樣制備2張新鮮玻片，再次評估。評定：活精子頭部呈白色，死精子頭部呈紅色和或暗粉紅色。精子形態(tài)學(xué)檢測：采用Diff-Quik快速染色試劑盒進行染色觀察。制備精子涂片，浸入快速染液1中10 s，快速染液2中5 s，流水沖洗，去除多余染液，封片觀察，計數(shù)200個精子，記錄正常精子個數(shù)。

1.2.3精子功能檢測 采用浙江星博生物科技有限公司DNA 碎片率細(xì)胞流式儀檢測試劑盒、精子線粒體膜電位細(xì)胞流式儀檢測試劑盒，嚴(yán)格按照其標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，采用BD Accuri C6 細(xì)胞流式儀器檢測。

1.2.4丙二醛(MDA)和ROS水平 使用硫代巴比妥酸(TBA) 比色法進行 MDA 檢測，選用南京建成生物制劑公司的 MDA 檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作，用分光光度計讀取吸光度值。選用GENMED精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性超氧陰離子細(xì)胞流式儀檢測試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作，BD Accuri C6 細(xì)胞流式儀器檢測其熒光強度。

1.2.5觀察指標(biāo) 觀察各組精子的PR、存活率、形態(tài)、MDA水平、ROS水平、DNA斷裂指數(shù)(DFI)、高DNA著色性(HDS)及精子線粒體膜電位(MMP)情況。

2 結(jié) 果

2.1精子相關(guān)參數(shù)情況 枸杞多糖組精子PR和存活率明顯高于離心組,低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。枸杞多糖組和離心組精子正常形態(tài)率明顯低于空白對照組(P<0.05)，枸杞多糖組與離心組之間無明顯變化(P>0.05)，見表1、圖1。

紅色虛線箭頭：該精子頸部異常；紅色實線箭頭：該精子頭部異常；黑色實線箭頭：該精子尾部異常；D：頭部染成紅色或暗粉色認(rèn)為死精子；L：頭部染成白色或淺粉色認(rèn)為活精子；標(biāo)尺：20 μm

圖1各組精子形態(tài)變化

圖2 各組細(xì)胞流式檢測

表1 3組精子PR、存活率和正常形態(tài)率比較

2.2DFI、HDS、MMP情況 枸杞多糖組和離心組DFI、HDS均明顯高于空白對照組(P<0.05)，枸杞多糖組低于離心組(P<0.05)，見表2、圖2。枸杞多糖組和離心組MMP(49.60±4.28)%、(42.76±3.65)%明顯低于空白對照組(57.97±6.23)%(P<0.05)，而枸杞多糖組高于離心組(P<0.05)。

2.3MDA、ROS水平 枸杞多糖MDA水平[(8.70±1.38)nmol/mL]與空白對照組[(8.12±1.50)nmol/mL]相近，明顯低于離心組[(11.44±1.88) nmol/mL](P<0.05)。枸杞多糖組ROS陽性細(xì)胞率[(15.38±4.45)%]明顯低于離心組[(29.15±5.20)%],但高于空白對照組[(2.96±1.61)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

表2 3組DFI和HDS水平比較

A：空白對照組；B：離心組；C：枸杞多糖組

圖3ROS熒光強度直方圖

3 討 論

ROS作為正常有氧代謝的產(chǎn)物,適量ROS在生理狀態(tài)下能調(diào)節(jié)精子功能,但過高水平就會對精子產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷[4]。氧化應(yīng)激造成的精子膜損傷和 DNA 斷裂，可誘發(fā)精子功能障礙和形態(tài)異常，并最終導(dǎo)致男性不育或子代異常[5]。因此，降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的精子損傷，可以提升精子活力，提高男性生育力。臨床上治療男性不育，在應(yīng)用左卡尼汀、谷胱甘肽等具有抗氧化的藥物后收到良好的效果[6]。

近幾年來,隨著人類輔助生殖技術(shù)飛速發(fā)展,人工授精和體外受精技術(shù)已廣泛用于治療少弱精癥和無精癥,并取得了較好的效果。在輔助生殖技術(shù)中,精子離心優(yōu)選過程打破了精液中的氧化平衡，會造成過量的ROS，對精子造成損傷。有研究表明，精子在體外與 ROS 共同孵育，可明顯增加 DNA 斷裂片段，甚至加速生殖細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致精液質(zhì)量明顯下降[7]。因此，在精子的離心處理中，提供抗氧化保護是很有必要的。

枸杞子是寧夏枸杞的干燥成熟果實，具有增強機體免疫、降血脂和抗衰老等作用[8]。枸杞多糖可以保護低密度脂蛋白，防止其氧化，并能有效清除自由基，可以增強體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-Px的活性[9]，使OH-ROS變成低毒性物質(zhì)，從而有效地阻止脂質(zhì)過氧化。已有研究證實枸杞多糖在培養(yǎng)小鼠睪丸組織時對生精上皮的熱損傷有很好的修復(fù)作用，并可降低DNA的氧化損傷[10]。枸杞多糖已被證實具有清除氧自由基、抗氧化的作用[11]。本課題組在前期研究冷凍保護劑的改良實驗中，發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可以降低冷凍過程中的氧化應(yīng)激，進而改善冷凍后精子的活力和功能，且最佳作用濃度為400 mg/L。在本試驗中離心組的MDA水平高于空白對照組，證實了離心過程中產(chǎn)生了過量的ROS；在離心前的精液中加入400 mg/L的枸杞多糖，與離心未干預(yù)組比較，MDA水平明顯降低，提示枸杞多糖可以降低弱精精子離心過程中的氧化應(yīng)激；干預(yù)組MDA水平和空白對照組之間無明顯差異，提示枸杞多糖起到了良好的抗氧化作用，細(xì)胞流式檢測ROS結(jié)果也證實了枸杞多糖抗氧化的結(jié)論。枸杞多糖組的ROS陽性細(xì)胞率亦明顯高于空白對照組，提示枸杞多糖可能降低了外環(huán)境過量的ROS，而對于內(nèi)源性ROS的降低作用不明顯，具體機制還需進一步研究。本研究細(xì)胞流式檢測足夠量的精子，比以往免疫熒光顯微鏡下計數(shù)200個精子的方法更具客觀性，避免了過多人為主觀因素的干預(yù)。

氧化應(yīng)激會破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，并通過氧自由基引起精子以 DNA 斷裂為主的 DNA 損傷及染色質(zhì)交聯(lián)等，造成精子結(jié)構(gòu)損傷，進而影響精子功能，引起少弱精癥及精子形態(tài)異常[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)離心過程會導(dǎo)致MMP降低,造成弱精精子DNA損傷，枸杞多糖干預(yù)可以減弱離心對弱精精子膜電位造成的影響,減少離心對精子的DNA損傷，這可能與枸杞多糖清除氧自由基、保護生殖細(xì)胞的作用有關(guān)[13-15]。

線粒體是精子運動的能量來源，對ROS極為敏感；ROS可以造成精子線粒體質(zhì)膜過氧化改變，尤其對線粒體內(nèi)膜而言，因為內(nèi)膜上有呼吸鏈和產(chǎn)生ATP的酶。線粒體受損，會導(dǎo)致MMP降低，精子功能下降[19]。枸杞多糖對精子線粒體的保護作用，改善了精子重要的能源工廠，本試驗加入枸杞多糖干預(yù)之后，離心后精子的PR和存活率都有明顯提高，但和空白對照組間尚有差異，結(jié)合前面所述氧化應(yīng)激的結(jié)果，提示枸杞多糖可以抗氧化，從而改善離心過程中精子的質(zhì)量，但并不能阻止完全過量ROS的生成，其還是會導(dǎo)致MMP的降低及精子DNA損傷。還需要進一步研究精子離心過程中的損傷機制和枸杞多糖的保護機制。

綜上所述，提取自天然植物枸杞中的枸杞多糖在弱精精子離心過程中，可以減少弱精精子的過氧化應(yīng)激，對精子起到了一定的保護作用；下一步會研究其保護作用的具體機制，從而豐富天然抗氧化劑的選擇，優(yōu)選更合適的保護劑，以保護弱精精子洗滌過程中的精子質(zhì)量和功能。