納米細菌感染在女性膀胱過度活動癥發(fā)生中的作用研究*

何 鵬,王永權,潘進洪,周占松,張 恒

(陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍泌尿中心,重慶 400038)

膀胱過度活動癥(overactive bladder,OAB)是女性泌尿系統(tǒng)極其常見的一種疾病。根據(jù)最新的國內泌尿外科診治指南，OAB的定義是一組以尿急癥狀為特征的癥候群，常伴有明顯尿頻和夜尿增多表現(xiàn)，可伴有或不伴有急迫性的尿失禁癥狀，部分患者有下腹及會陰部不適癥狀，嚴重影響女性患者的生活質量。目前穩(wěn)定膀胱的治療方法因周期長會導致較高的醫(yī)療費用，其診治和尋求有效的治療方法已成為國際泌尿界的難題[1-2]。然而女性OAB的病因至今仍不清楚，有逼尿肌不穩(wěn)定、膀胱黏膜感覺功能過敏及神經(jīng)內分泌學說等。臨床實踐中發(fā)現(xiàn)女性OAB患者多有尿路感染病史，且檢查尿中微生物高于正常對照，抗感染治療常有效，表明膀胱黏膜有隱匿性感染，即病原微生物引起OAB的可能。目前為止，仍沒有在女性OAB患者中明確檢出相關的病原體，因此對未知的病原體進行探索有可能對該病的臨床診治產(chǎn)生較大的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年5月至2017年10月在本院泌尿外科門診確診為OAB的25例女性患者為研究對象，年齡21～55歲，中位年齡31歲，尿常規(guī)和培養(yǎng)結果均為陰性。

1.2方法

1.2.1NB培養(yǎng) 嚴格清潔患者尿道外口后，收集10 mL中段尿，孔徑0.45 μm濾器過濾，4 ℃ 20 000 g離心，棄上清液后留取管底1 mL，再加入無菌生理鹽水稀釋5倍，充分混勻，0.22 μm濾器再次過濾，同樣條件再次離心，留取管底沉淀1 mL。加入4 mL 10% γ-FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在5%CO2、pH 7.4、37 ℃的條件下無菌培養(yǎng)。

1.2.216S rRNA鑒定 將1 mol/L HCl 0.5 mL加入菌液標本，充分混勻,水浴30 min，37 ℃；1 mol/L Tris堿0.5 mL加入中和，4 ℃ 20 000 g離心40 min。管底沉淀使用細菌基因組提取試劑盒提取后進行PCR擴增。NB 16S rRNA基因序列(GenBank登錄號:X98419)上游引物5′-AAC GAA CGA CTG GGG CGG CAG GC-3′,下游引物5′-CAC CCC AGT CGC TGA CCC-3′。PCR反應體系： 模板DNA 3 μL，PCR 2×TaqPCR Master-Mix 12.5 μL，上游引物1.0 μL(10 μmol/L)，下游引物1.0 μL(10 μmol/L)，加DDH2O至25.0 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。所有循環(huán)結束后，取5.0 μL反應產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標基因。

1.2.3NB對膀胱黏膜上皮細胞的影響 將培養(yǎng)的膀胱黏膜上皮細胞(上海然泰生物公司)分為空白對照組(胎牛血清、1640培養(yǎng)液+膀胱黏膜上皮細胞) 和NB組(光密度2.00的NB 菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+膀胱黏膜上皮細胞)，在12、24 h分別進行光鏡和透射電鏡的觀察。細胞經(jīng)胰酶消化、離心,標本再轉移至EP管內，PBS清洗10 min,加入質量分數(shù)3%戊二醛，固定1～2 h,PBS清洗2次,加入質量分數(shù)1%的鋨酸，固定1～2 h,再用PBS清洗2次,依次使用50%、70%和90%的乙醇梯度脫水，再無水乙醇脫水3次。環(huán)氧丙烷浸透，Epon812包埋和聚合，80 ℃過夜。超薄切片后鈾、鉛染色。4 000倍及20 000倍顯微鏡下觀察制片的細胞形態(tài)與結構變化。

1.2.4細胞損傷的指標檢測 通過測定培養(yǎng)12、24 h后乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)來評價細胞膜的損傷程度及是否有脂質過氧化參與損傷過程中。LDH和MDA測試盒比色法分別測定上清液LDH和MDA水平，所有操作按試劑盒(上海生工)說明書進行。

2 結 果

2.1PCR法擴增NB 16S rRNA 25例尿液標本培養(yǎng)4周后，可觀察到17例(68%)管底出現(xiàn)絮狀的乳白色沉淀物，將培養(yǎng)標本離心后通過16S rRNA進行擴增鑒定，發(fā)現(xiàn)15例(60%)在1 406 bp處可見NB的特異性條帶，證明所收集標本培養(yǎng)的細菌為NB，見圖1。

圖1 16S rRNA基因片斷擴增

2.2NB對膀胱黏膜上皮細胞的損傷作用 空白對照組膀胱黏膜上皮細胞規(guī)則,細胞核及細胞質形態(tài)致密,線粒體形態(tài)正常，核膜完整，無明顯異常。NB組細胞12 h細胞質內可見較大空泡樣變，線粒體腫脹，24 h后部分細胞可見核膜溶解,核仁消失，見圖2。

A:正常對照，細胞形態(tài)規(guī)則；B:細胞皺縮，脫落；C:細胞質內可見散在的空泡樣變；D:核膜溶解，核仁消失

圖2細胞形態(tài)與結構變化

2.3MDA和LDH水平變化 NB組MDA和LDH水平在12、24 h均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同時間點兩組LDH和MDA水平變化

3 討 論

NB的發(fā)現(xiàn)及其致病特點為闡明女性OAB的病因提供了一條嶄新的思路。NB是一種非常特殊的細菌，1992年芬蘭科學家KAJANDER等在哺乳動物細胞培養(yǎng)時偶然發(fā)現(xiàn)，該細菌革蘭氏染色呈陰性，大小為50～200 nm，外觀多呈球狀或有一端突起，不像普通細菌一樣有莢膜與鞭毛，該細菌對四環(huán)素有特殊的敏感性，并在特殊的RPMI 1640或DMEM等哺乳類細胞培養(yǎng)基中才能生長。由于具有很多特性，且體積微小，KAJANDER等將之命名為Nanobacteria，進一步的研究發(fā)現(xiàn)NB確實存在，而不是體積上的納米顆粒，并且和很多病因不明的感染性疾病有關[3]。

目前的研究證實，NB在人群中的感染率較高，可能會導致多種感染性疾病，其潛在的致病作用引起了臨床上的廣泛關注[4]。NB感染雖然與多種人類疾病的發(fā)生有關,但普通臨床的檢測方法不能確診，NB具有特異的16S rRNA序列，因此，可以通過16S rRNA基因片段擴增來鑒定NB[5-6]。NB致病機制主要包括兩個方面：(1)NB生長過程中可以形成堅硬的生物外殼，成分主要是羥磷灰石碳酸鹽礦物結晶，導致被感染細胞發(fā)生類似骨骼樣的病理性鈣化，從而使組織器官硬化，這種病理改變在人類多種系統(tǒng)中均可發(fā)現(xiàn)，但病因一直不明。(2)NB通過分泌一些生物毒素及細胞炎性因子(如白細胞介素-1、白細胞介素-6和內毒素等)，引起了感染組織的炎癥和慢性疾病。

泌尿系統(tǒng)是體內感染的NB主要的排出通道，因此可能與男性泌尿生殖系的感染性疾病有關，現(xiàn)在明確在泌尿系結石、前列腺和睪丸鈣化患者的標本中相繼培養(yǎng)出NB。目前眾多研究證實NB感染和腎結石形成有關，通過單克隆抗體免疫熒光染色對70余例腎結石標本培養(yǎng)的NB進行鑒定，發(fā)現(xiàn)感染率高達97.2%，發(fā)病機制可能與NB導致的細胞脂質過氧化等反應有關[7-9]。筆者所在部門的前期研究證實NB感染和慢性前列腺炎有關，并可能是導致前列腺結石形成的致病因素，通過從臨床確診的Ⅲ型前列腺炎患者分離培養(yǎng)出的NB，再灌注入實驗大鼠前列腺，可以有效地導致前列腺的炎癥，通過四環(huán)素治療可明顯的緩解[10-11]。

女性OAB的病因仍不清楚，但有研究表明，許多OAB患者曾有尿路感染，抗感染治療也常有效，膀胱黏膜有可能存在非常規(guī)的隱匿性感染，即特殊病原微生物引起OAB的可能。NB的生物礦化能力可能導致軟組織感染、損傷和鈣化，進而可能導致其他疾病，NB可能是鈣化相關疾病和感染病因不明確的疾病的一個因素,其與因為鈣化形成的屏障導致臨床治療的困難[12]。NB可能參與了OAB致病的主要依據(jù)有：NB可感染人體多種細胞，體內感染的NB主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出，因而其在泌尿系統(tǒng)中的潛在感染不容忽視。NB在普通的微生物培養(yǎng)條件下不能生長繁殖，可能與臨床上很多OAB患者尿液標本采用常規(guī)微生物培養(yǎng)法檢測不出病原，但膀胱黏膜卻有慢性炎癥存在有關。本研究發(fā)現(xiàn)，在女性OAB患者尿液中可以分離培養(yǎng)出NB，并且導致培養(yǎng)的膀胱黏膜上皮細胞損傷，因此，可以推測NB的感染可能參與了OAB患者膀胱黏膜上皮細胞損傷，導致膀胱黏膜的慢性炎癥。但目前還有待進一步的研究，主要是因為納米顆粒也有可能致細胞的損傷，即有生命的NB和納米顆粒的鑒別還需要更多的實驗來證實。但從目前的研究結果來看，深入探討NB在OAB中的病因作用，有望為該病的臨床治療提供新的病原學依據(jù)。