硒對線粒體STAT3活性表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響研究*

楊勝祥，張旭濤，華曉芳△

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院/武漢大學(xué)恩施臨床學(xué)院,湖北恩施 445000;2.湖北省建始縣中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，湖北恩施 445300)

硒是人體必需的微量元素，通過在機(jī)體中輔助多種酶類重要的調(diào)節(jié)功能，維持人體健康[1]。大量的臨床數(shù)據(jù)及科研報道顯示硒與心血管疾病存在相關(guān)性。冠心病的發(fā)病率與血硒水平存在逆向相關(guān)，血硒水平是判定冠心病的重要指標(biāo)[2]。動脈粥樣硬化的主要原因是內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，低硒導(dǎo)致抗氧化酶類活性下降，加劇動脈粥樣硬化，補(bǔ)硒對動脈粥樣硬化患者有明顯的治療效果[3]。此外，低硒也是導(dǎo)致克山病的主要原因，其病理學(xué)表現(xiàn)為心肌壞死[4]。因此，硒在心肌細(xì)胞的凋亡中具有重要作用。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(the signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在心臟各類細(xì)胞形成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。STAT3具有多種功能，其中就包含可以影響線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔，參與能量代謝的調(diào)控，線粒體STAT3的表達(dá)及活性變化也可以從側(cè)面反映心肌細(xì)胞的活性[5]。琥珀酸脫氫酶定位于線粒體內(nèi)膜，參與線粒體產(chǎn)生腺苷三磷酸(ATP)的過程，其水平變化代表細(xì)胞內(nèi)線粒體的活性。

低硒影響線粒體STAT3表達(dá)量[6]，但是與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系仍不清楚。因此，本實驗采用乳鼠原代心肌細(xì)胞，通過低硒培養(yǎng)液和正常硒培養(yǎng)液培養(yǎng)，檢測STAT3、琥珀酸脫氫酶及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討低硒對線粒體活性和心肌細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取出生3 d的C57BL/6小鼠6只，體質(zhì)量(10±0.2)g，購自南京模式動物中心，見圖1。

圖1 出生3 d的乳鼠

1.2儀器與試劑 琥珀酸脫氫酶活性檢測試劑盒購自美國Sigma公司，分光光度計購自美國Thermo公司，免疫印跡抗體均購自美國Abcam公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1乳鼠心肌細(xì)胞提取和培養(yǎng) 乳鼠浸入75%無水乙醇1～2 min，剪開胸骨，取出心臟，置于預(yù)冷的Hanks培養(yǎng)液，去除心臟周圍的多余組織。用預(yù)冷的Hanks漂洗3次，將心臟放入胰酶中剪碎。37 ℃水浴10 min，自然沉淀后棄上清液。再次胰酶消化10 min，移液器混勻，加培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)6次。將消化所得細(xì)胞1 000 r/min離心10 min，加入適量培養(yǎng)基混勻，置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.2低硒培養(yǎng)液濃度確定 取生長良好的原代心肌細(xì)胞，分別用含有0、0.01、0.05、0.08、0.10、0.50 μmol/L和1.00 μmol/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液及正常培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，見圖2。36 h后檢測不同濃度硒處理組細(xì)胞凋亡率。乳酸脫氫酶(LDH)檢測發(fā)現(xiàn)，0.10 μmol/L硒處理組與正常培養(yǎng)液組毒性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可作為正常硒對照組，而過高或過低的硒濃度均表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞凋亡率，0.05 μmol/L硒處理組心肌細(xì)胞凋亡率為50%，后續(xù)實驗以含0.05 μmol/L硒的培養(yǎng)液作為低硒組。

A：0；B：0.01 μmol/L；C：0.05 μmol/L;D：0.08 μmol/L

圖2不同濃度亞硒酸鈉刺激原代心肌細(xì)胞病理圖片(×50)

1.3.3心肌細(xì)胞線粒體提取 取適量的對照組和低硒處理組心肌細(xì)胞，胰酶消化離心后加入適量的細(xì)胞裂解液，置于勻漿器，冰上研磨。4 ℃ 1 200 g離心15 min去除細(xì)胞核后，10 000 g離心10 min，棄上清液得到線粒體沉淀。加入適量的線粒體儲存液-80 ℃保存線粒體。

1.3.4線粒體琥珀酸脫氫酶活性檢測 待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品按說明書稀釋比例配好，加入酶標(biāo)包被板。封板37 ℃孵育30 min。棄去液體，用提前配好的洗滌液清洗5次，每孔加酶標(biāo)試劑50 μL后，封板37 ℃孵育30 min。用洗滌液清洗5次后顯色，37 ℃避光顯色15 min，采用分光光度計于600 nm檢測琥珀酸脫氫酶活性。

1.3.5免疫印跡法檢測STAT3、p-STAT3及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2水平 取對照組和低硒組心肌細(xì)胞線粒體，裂解后Nanodrop 2000(美國Thermo公司)檢測蛋白濃度。取相同量的線粒體裂解液或全細(xì)胞裂解液，加入SDS凝膠，80 V 120 min電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜4 h。5 %無糖脫脂奶粉封閉1 h，按抗體說明書稀釋比例孵育一抗室溫4 h，TBST清洗3次，室溫孵育二抗1 h后，于暗室顯影。Image J灰度分析檢測各條帶光密度值。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡率 收集對照組和低硒組心肌細(xì)胞，0.01 mol/L PBS洗滌后加入預(yù)冷的70%無水乙醇固定2 h。PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)過濾網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。PI染色液4 ℃避光孵育0.5 h。流式細(xì)胞儀于488 nm檢測心肌細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1心肌細(xì)胞線粒體酶活力及STAT3表達(dá)變化 低硒處理原代心肌細(xì)胞36 h后，提取對照組和低硒組心肌線粒體，檢測琥珀酸脫氫酶活力變化。與對照組相比，低硒組琥珀酸脫氫酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A。p-STAT3是STAT3的活性狀態(tài)，線粒體裂解后，通過免疫印跡檢測線粒體p-STAT3和總STAT3的表達(dá)情況，并以p-STAT3與總STAT3比值來顯示STAT3活性。結(jié)果顯示低硒組線粒體STAT3活性與對照組相比明顯降低(P<0.01)，但總STAT3差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3B。

圖3 兩組心肌細(xì)胞琥珀酸脫氫酶酶活性及STAT3表達(dá)變化

2.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化 與對照組比較，低硒組Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 兩組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)量變化

2.3心肌細(xì)胞凋亡情況 PI熒光點圖觀察到，對照組細(xì)胞主要為非凋亡細(xì)胞，而低硒組心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。低硒組心肌細(xì)胞凋亡率為(42.62±2.21)%，高于對照組的(6.13±2.32)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

圖5 兩組心肌細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

硒元素作為人體必需的微量元素之一，與抗氧化、機(jī)體免疫、衰老、疾病等方面有重要的聯(lián)系[7]。硒缺乏導(dǎo)致的疾病，絕大多數(shù)都是由氧化損傷引起。研究發(fā)現(xiàn)，由血硒含量降低引起的心肌細(xì)胞損傷主要以線粒體損傷為主，體現(xiàn)在線粒體膜受損，活性氧產(chǎn)生，脂類氧化物含量升高，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[8]。作為線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，p-STAT3和細(xì)胞損傷緊密相關(guān)[9]。大量的臨床數(shù)據(jù)和研究結(jié)果表明STAT3蛋白在心肌病患者和模型動物均表達(dá)降低，提示STAT3參與心肌病病理學(xué)過程[10]。研究發(fā)現(xiàn)STAT3與線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ共同作用，在保留電子傳遞鏈復(fù)合物和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)ATP水平以維持正常線粒體的保護(hù)功能中起十分重要的作用[11]。相關(guān)研究表明，硒能夠上調(diào)細(xì)胞中STAT3活性，從而實現(xiàn)其對下游基因的調(diào)控，參與細(xì)胞的凋亡過程[12]。有研究表明，線粒體STAT3的活性與大鼠心臟功能有著明顯的正相關(guān)[13-14]。本研究分離了C57BL/6乳鼠心肌細(xì)胞，通過低硒處理模擬心肌細(xì)胞硒缺乏后的病理環(huán)境。分離心肌細(xì)胞線粒體后，通過免疫印跡檢測p-STAT3/STAT3的變化顯示線粒體STAT3的活性變化。筆者發(fā)現(xiàn)，低硒條件下STAT3的活性下降，但是STAT3蛋白表達(dá)量并沒有發(fā)生改變。檢測琥珀酸脫氫酶活性可以間接表明線粒體活性變化，結(jié)果顯示低硒處理后心肌細(xì)胞的線粒體活性也受到影響，與對照組相比有明顯的降低。這些結(jié)果表明低硒處理后影響了心肌細(xì)胞線粒體STAT3的活性，從而導(dǎo)致線粒體功能受損。

STAT3在心肌缺血模型中起保護(hù)作用，但是由硒缺失引起的心肌細(xì)胞損傷對線粒體STAT3活性影響是否會引起凋亡信號的產(chǎn)生促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡還未有明確的報道，因此筆者采用離體的心肌細(xì)胞通過低硒處理，在細(xì)胞水平上研究這一問題。在STAT3受到低硒影響的前提下，檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示低硒組Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，低硒處理后導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡率上升。

綜上所述，硒缺乏降低了心肌細(xì)胞線粒體STAT3活性和線粒體活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步闡明了硒缺乏導(dǎo)致心肌疾病的致病機(jī)制，為硒相關(guān)治療藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。