愛康方含藥血清對小鼠Lewis細胞PI3K和AKT mRNA水平的影響研究*

馬 科，林 瑩，戴永福，馬治國，周麗萍，李巧玲，伏柏濃，夏淑敏，田亞佳

(1.寧夏醫科大學，銀川 750004；2.銀川市中醫醫院，銀川 750001；3.寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院，寧夏吳忠 751100；4.寧夏醫科大學總醫院，銀川 750004；5.銀川市明德中醫醫院，銀川750001)

有報道表明，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/AKT)通路中多個組分可作為單獨或聯合治療肺癌的靶點，PI3K的過表達，涉及激活一個復雜信號網，在肺癌細胞中沉默催化的亞基PI3K可以減少非小細胞肺癌(NSCLC)細胞的增殖[1]，故PI3K是其癌癥治療理想靶點[2-3]。國內對于PI3K/AKT實驗在中醫領域內的相關研究較少，目前除單味中藥外，復方中藥對其通路的研究較之更少，尤其對于Lewis細胞關于復方對其通路的研究。因此，從復方角度出發，愛康方具有清熱、化痰、散瘀散結、解毒、排膿、抗癌作用，在前期已證實該方促進Lewis細胞凋亡的實驗基礎上[4]，重新選取PI3K/AKT信號傳導途徑，以Lewis細胞作為研究對象，沿襲課題組前期制備含藥血清的方法，以20%濃度為最佳含藥血清將其進行細胞培養[5-6]。觀察愛康方含藥血清對小鼠Lewis細胞PI3K和AKT mRNA水平的影響，進而探討該方對其細胞的凋亡作用是否與PI3K/AKT信號通路有關，進一步明確抗NSCLC的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠80只,體質量(250±20)g，生產許可證號：SCXK(寧) 2016-0001，購自寧夏醫科大學動物實驗中心。

1.1.2細胞株 小鼠Lewis細胞株(KG070)購自江蘇南京凱基生物公司。

1.1.3試劑與儀器 愛康方由金蕎麥、通關藤、生薏米、桃仁、紫珠葉、三七、血余炭及花蕊石組成，購自明德藥業公司。臭殼蟲購自云南楚雄市元謀縣元馬鎮，環磷酰胺針粉劑購自寧夏醫科大學腫瘤醫院門診部(批號：06257008，規格：0.2 g/支)。天根RNA提取總試劑盒(批號:DP419)、第一鏈 cDNA 合成逆轉錄試劑盒(批號:K1622)、DBI/熒光MIX試劑盒(批號:2043)、PIK3ca和AKT1基因的引物購自上海生工生物有限公司，來源小鼠的內參引物GAPDH(編碼：PHS04)。CO2培養箱(5510.NO-US ENUAIR)，超凈工作臺(BCM型-SJAT-1300A)，酶標儀(美國BIO RAD-680 XMarkTMMicroplate)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS-CKX31)，Image pro-plus相機顯微鏡(US-OLYMPUS DP73)，實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD iQ5)。

1.2方法

1.2.1藥物制備[7]愛康方：金蕎麥30 g、通關藤30 g、薏苡仁30 g、桃仁12 g、紫珠葉30 g、臭殼蟲6 g、化雪丹(由三七、花蕊石、血余炭組合)20 g，共158 g，藥品鑒定后參照人與動物體表面積換算及課題組前期實驗所采用傳統水煎藥物制備法[6-7]，藥液濃縮致每1 mL含生藥量分別為1.58 g(低劑量)、3.16 g(中劑量)、4.74 g(高劑量)，相當于臨床等效計量的1、2、3倍。 所有藥物儲存條件為4 ℃備用。

1.2.2含藥血清的制備[5-6]參照前期課題組制備含藥血清方法并重復實驗步驟，將SD大鼠分為生理鹽水對照組(NS組)，愛康方低、中、高劑量組，環磷酰胺組(CTX組)，低、中、高劑量聯合CTX組(低劑量+CTX組、中劑量+CTX組、高劑量+CTX組)，每組10只。給藥方式:已濃縮的低、中、高劑量的愛康方一次給予1×106mg/mL灌胃，每天2次，CTX按20 mg/kg于第1、3、5、7天腹腔注射。第7天給藥結束3 h后，用10%水合氯醛(0.3 mL/kg)將大鼠麻醉進行心臟取血，靜置35 min，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，在 58 ℃水浴滅活35 min，0.22 μm濾器過濾后同組內進行混合于-79 ℃保存備用。

1.2.3細胞培養及分組 用含1%雙抗、10%胎牛血清高糖型培養基培養Lewis細胞，將其培養瓶放在38 ℃、5% CO2條件下的培養箱內，待第2天細胞鋪滿瓶底約80%進行傳代，最后取對數生長期細胞進行實驗。依據SD大鼠分組對應所制備的含藥血清，每組均調配成20%最佳含藥血清一一對應干預細胞，使之細胞分組為實驗組(低劑量組、中劑量組、高劑量組、CTX組、低劑量+CTX組、中劑量+CTX組、高劑量+CTX組)，對照組為NS組，再補充只加DEME培養基作為空白對照組。

1.2.4real-time PCR檢測PI3K和AKT mRNA水平 將2.0×106個Lewis細胞接種于25 cm2透氣培養后放于培養箱瓶繼續培養，待藥物干預24、48 h后，依照RNA總提取試劑盒步驟操作，提取的RNA經濃度純度比對且依照反轉錄添加范圍體系添加后上PCR儀機，反應獲得cDNA樣板按照DBI/熒光 qPCR MIX試劑盒說明書中反應體系添加到pcr八排管(每組設3個復孔)后在BIO-RAD iQ5實時熒光定量PCR儀上進行擴增。PCR反應條件，95.0 ℃ 2 min;95.0 ℃ 10 s,58.0 ℃ 30 s,72.0 ℃ 30 s,40 個循環，啟用數據和實時分析；55.0～98.0 ℃ 10 s,每兩個循環數增加 0.5 ℃,共87 個循環,溶解曲線數據收集分析啟用;4.0 ℃ 1 min。由NCBI數據庫檢索獲得PIK3ca(NM_008839.2)、AKT1(NM_001165894.1)基因序列送至上海生工生物有序公司所設計引物序列。PIK3ca：正義鏈5′-GGT GGA ATG AAT GGC TGA AT-3′，反義鏈5′-CGG ACA GTG CTC CTC CTT AG-3′；AKT1：正義鏈5′-AGA TTG TGT CTG CCC TGG AC-3′，反義鏈5′-AGC CCG AAG TCC GTT ATC TT-3′；內參：GAPDH(即用型)。

圖1愛康方含藥血清作用Lewis細胞不同時間點PI3K、AKT溶解曲線

2 結 果

2.1溶解曲線 圖1所示溶解曲線為單峰，基因設計引物具有特異性，擴增產物單一。

表1 愛康方含藥血清作用小鼠Lewis細胞24、48 h PI3K mRNA水平比較

2.2愛康方含藥血清對小鼠Lewis細胞PI3K mRNA水平的影響 24 h時NS組及各實驗組PI3K mRNA水平均低于空白對照組(P<0.05)；中劑量組、低劑量組、高劑量組PI3K mRNA水平逐次降低但高于CTX組，中、低劑量+CTX組PI3K mRNA水平逐漸低于CTX組(P<0.05)。48 h時，NS組PI3K mRNA水平高于空白對照組(P<0.05)，低劑量組、CTX組PI3K mRNA水平僅稍低于空白對照組(P<0.05)；NS組>空白對照組>低劑量組>CTX組>中劑量+CTX組>高劑量組>高劑量+CTX組>低劑量+CTX組>中劑量組。48 h中劑量、高劑量、高劑量+CTX組PI3K mRNA水平低于24 h，但48 h低劑量組、CTX組、低劑量+CTX組、中劑量+CTX組PI3K mRNA水平并未明顯低于24 h，轉錄水平未隨時間點設置而降低，見表1。愛康方不同劑量及不同劑量協同CTX含藥血清作用小鼠Lewis細胞PI3K mRNA水平有所降低。

表2 愛康方含藥血清作用小鼠Lewis細胞24、48 h AKT mRNA水平比較

2.3愛康方含藥血清對小鼠Lewis細胞AKT mRNA水平的影響 24 h時NS組AKT mRNA水平明顯低于空白對照組，除低劑量組，其余各實驗組水平均明顯低于空白對照組(P<0.05)。低、中、高+CTX組和中、高劑量AKT mRNA水平低于CTX組。48 h時各組AKT mRNA水平明顯低于空白對照組(P<0.05)，CTX組、低、高劑量組及中、高劑量+CTX組水平降低明顯。兩個時點除低、高劑量組、CTX組，其余各組轉錄水平降低不明顯，見表2。愛康方及不同劑量協同CTX含藥血清可降低小鼠Lewis細胞AKT mRNA水平。

3 討 論

近年來有大量文獻報道PI3K/AKT信號通路在腫瘤侵襲、轉移的調控方面發揮了重要作用[8]，在NSCLC的研究方面亦有關于該通路能發揮促使細胞凋亡作用的報道[9]。該信號通路的激活主要是由多種因子跨膜刺激后激活了PI3K，使產生PIP3與胞內PH域相應信號分子或蛋白結合磷酸化，進而激活其下游一系列相關分子，若用抑制劑或藥物干預有可能抑制此通路促進肺癌細胞的凋亡[8,10]。張星星等[11]用芪玉三龍湯干預Lewis細胞混懸液皮下種植小鼠建立的荷瘤模型后發現PI3K、AKT蛋白的表達降低，且對荷瘤有明顯抑制效果，這可能與調控PI3K/AKT信號通路關鍵分子有關。補中益氣湯[12-13]、補腎疏肝經驗方[14]，抑制人肺癌細胞增殖和轉移可能與PI3K-AKT信號通路交互作用而發揮了抗癌效果。

中醫學認為肺癌的發生與痰、瘀、毒邪侵襲密切相關，筆者總結的經驗方-愛康方發揮著清熱解毒、消瘀散結的抗癌功效[4]。復方中金蕎麥可解肺熱之毒，薏苡仁滋養入肺以促排濕毒，通關藤平喘祛痰解毒[15]。資料[16]顯示該藥也通過PI3K/AKT通路抑制卵巢癌細胞增殖；桃仁、紫珠葉、三七、血余炭及花蕊石共同發揮化瘀止血生新、解毒，臭殼蟲散結尤顯。前期課題組實驗已得出愛康方含藥血清誘導小鼠Lewis細胞凋亡的結論，且不同劑量與時間呈一定依賴性，CTX組作為陽性對照，高劑量聯合CTX阻滯Lewis細胞于G1期，72 h細胞抑制率高達54.71%，充分表明愛康方可以增強對CTX抑制作用[5-6]。 本實驗使用最佳含藥[14]血清體外干預小鼠Lewis細胞以觀察PI3K、AKT mRNA水平，探討該方促進小鼠Lewis細胞凋亡是否與PI3K/AKT信號通路作用機制有關。

本實驗從反轉錄水平角度檢測小鼠Lewis細胞PI3K、AKT mRNA水平。以空白對照組為參考基準，24 h時各實驗組PI3K mRNA水平明顯降低，低劑量+CTX組最為明顯。48 h時，NS組PI3K mRNA水平高于空白對照組，低劑量、CTX組僅稍低于空白對照組，余實驗組PI3K mRNA水平明顯降低：中劑量+CTX組>高劑量組>高劑量+CTX組>低劑量+CTX組>中劑量組，其中高劑量組<中劑量+CTX組，中劑量<中、高、低+CTX組，可考慮內部上下堿基探針結合等內部不可避免因素，具體有待進一步探究。48 h中劑量、高劑量、高劑量+CTX組PI3K mRNA水平較24 h降低，48 h低劑量組、CTX組、低劑量+CTX組、中劑量+CTX組PI3K mRNA水平較24 h稍高，說明轉錄水平可能不隨時間點降低。24 h時除低劑量組，各實驗組AKT mRNA水平均明顯低于空白對照組，48 h各實驗組AKT mRNA水平明顯降低，且與24 h相比轉錄水平不隨時間降低。說明愛康方不同劑量含藥血清可能不隨時間依賴性而降低PI3K、AKT mRNA水平，聯系PI3K/AKT通路相關研究機制，含藥血清刺激細胞膜后激活PI3K，胞內PH結構域與相關靶基因或蛋白結合，繼而活化AKT，隨時間變化，PH結構域識別有一定特異性，不一定完全使靶基因或靶蛋白磷酸化[17]，再加中藥含藥血清成分復雜，可能存在多靶點作用，具體仍待進一步探究。愛康方不同劑量及不同劑量聯合CTX是從藥物濃度依賴性干預Lewis細胞，跨膜刺激作用于PI3K，繼而抑制AKT活化，促使細胞凋亡。總體上來講，實驗結果說明愛康方不同劑量及不同劑量聯合CTX含藥血清作用小鼠Lewis細胞PI3K、AKT基因水平有所降低。

綜上所述，愛康方含藥血清能降低小鼠Lewis細胞PI3K、AKT mRNA水平，且與CTX協同發揮作用，說明該細胞凋亡作用可能與PI3K/AKT信號通路有關，具體通過該通路哪些作用靶點仍需后續實驗進一步驗證。