IL-33在鼻咽癌中的作用及其潛在的分子機(jī)制

阮 鵬，譚愛(ài)麗

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院:1.腫瘤科;2.婦產(chǎn)科,武漢 430060)

鼻咽癌是一種具有獨(dú)特生物學(xué)行為的頭頸部惡性腫瘤，每年有數(shù)十萬(wàn)患者被診斷為鼻咽癌，在中國(guó)沿海南部發(fā)病率較高[1]。目前，鼻咽癌的治療仍以放化療為主，療效尚不能令人滿意，其遠(yuǎn)期預(yù)后不良，5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)55%[2]。因此，進(jìn)一步研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn),對(duì)鼻咽癌的治療具有重要意義。腫瘤的發(fā)生被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞與其周圍基質(zhì)相互作用的結(jié)果，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是構(gòu)成腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的主要成分，在腫瘤組織中廣泛存在[3-4]。研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能主動(dòng)抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起重要作用[5]。腫瘤干細(xì)胞是一種具有類似于干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，具有自我增殖、更新、分化等特性[6]。研究表明，鼻咽癌細(xì)胞中亦存在少量腫瘤干細(xì)胞，而針對(duì)其的研究仍十分有限[7]。

白細(xì)胞介素(IL)-33是IL-1家族的新成員，具有多種功能，在炎癥、感染、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[8]。IL-33通過(guò)與其受體ST2結(jié)合，可誘導(dǎo)Th2型促炎因子和趨化因子的分泌，引起靶器官的一系列炎性反應(yīng)[9]。研究表明，IL-33在多種炎性相關(guān)疾病，如哮喘、皮炎、關(guān)節(jié)炎、病毒感染、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用[8-12]。而針對(duì)IL-33在鼻咽癌中的作用少見(jiàn)報(bào)道，本研究探討IL-33在鼻咽癌中的作用及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2018年1月本院收治的78例鼻咽癌患者為研究對(duì)象，依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)頭頸外科學(xué)分會(huì)制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行診斷，所有患者均經(jīng)病理活檢或術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)，均未經(jīng)任何治療。根據(jù)2010年修改的國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)行分期，見(jiàn)表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性鼻咽癌；有放化療史；臨床資料不完整，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；近期及長(zhǎng)期服用影響機(jī)體免疫功能的藥物；并發(fā)其他腫瘤；伴嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙，全身感染性疾病；妊娠期或哺乳期女性；長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良；長(zhǎng)期臥床；中途退出治療、臨床數(shù)據(jù)缺失。另選取30例同期在本院進(jìn)行治療的鼻咽黏膜慢性炎癥患者作為對(duì)照，男19例，女11例，年齡31～68歲，平均(47.7±15.8)歲。兩組患者的性別、年齡相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 患者的基本信息

1.2材料與設(shè)備 人IL-33 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems)；重組人IL-33蛋白(武漢艾美捷科技有限公司)；IL-33抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；NANOG、NOTCH3、OCT3/4抗體(美國(guó)CST公司)；p-ERK、ERK、p-MAPK、MAPK、p-NF-κB、NF-κB、p-c-Jun、c-Jun抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；FITC標(biāo)記的CD68抗體、APC標(biāo)記的F4/80抗體(美國(guó)BioLegend公司)；SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Takara公司)；Real-time PCR試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)；NANOG、NOTCH3、OCT3/4與GAPDH引物(武漢擎科偉業(yè)生物有限公司)；JNK特異性抑制劑SP600125(美國(guó)Selleckchem公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；X-VIVO成球培養(yǎng)基(美國(guó)Lonza公司)；青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)；5-8F及CNE-2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，對(duì)照及IL-33-BALB/c轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院。CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR儀、Tecan酶標(biāo)儀、Bio-Rad垂直電泳儀、Bio-Rad Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1Western blot 收集鼻咽癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織，癌旁正常組織取材于距癌周2 cm處，碾磨，RIPA裂解液(含cocktail蛋白酶抑制劑)裂解提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣80～120 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。經(jīng)5%BSA封閉后，加NANOG、NOTCH3、OCT3/4抗體(1∶1 000)；p-ERK、p-MAPK、p-NF-κB、p-c-Jun抗體(1∶2 000)；ERK、MAPK、NF-κB、c-Jun抗體(1∶3 000)；β-actin抗體(1∶5 000)；4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)洗滌，加二抗(凱基生物公司)室溫孵育1 h。洗滌，DAB顯色。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色 采用SP法檢測(cè)IL-33水平。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復(fù)，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗5 min×3次。用10%正常非免疫羊血清37 ℃孵育60 min，滴加一抗工作液4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37 ℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37 ℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.3.3Real-time PCR 收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書步驟進(jìn)行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR，取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR循環(huán)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列如下，NANOG正義鏈：5′-TAC CTC AGC CTC CAG CAG AT-3′，反義鏈：5′-CTT CTG CGT CAC ACC ATT GC-3′；NOTCH3正義鏈：5′-CCT GCG ATC AGG ACA TCA AT-3′，反義鏈：5′-CCA CGT GGT CGG TAC AGG-3′； OCT3/4正義鏈：5′-GCT GGA GAA GGA GAA GCT GG-3′，反義鏈5′-AAA GCG GCA GAT GGT CGT TT-3′；內(nèi)參β-actin正義鏈：5′-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC C-3′，反義鏈：5′-ACG ACC AGA GGC ATA CAG G-3′。

1.3.4成球?qū)嶒?yàn) 取正常培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，使用X-VIVO成球培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至2 000/mL，鋪板24孔低黏附細(xì)胞板，每孔0.5 mL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周后拍照計(jì)數(shù)。

1.3.5小鼠模型的建立及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 正常及IL-33轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CNE-2鼻咽癌細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107/mL的單細(xì)胞懸液，無(wú)菌條件下接種于小鼠左前肢腋窩結(jié)合部皮下，每只0.2 mL，2周后接種小鼠均出現(xiàn)直徑大于5 mm的皮下結(jié)節(jié)，鼻咽癌小鼠模型建立成功。取新鮮小鼠鼻咽癌腫瘤組織，RPMI-1640培養(yǎng)基中過(guò)夜消化后進(jìn)行研磨，經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入離心管，根據(jù)說(shuō)明書加入適當(dāng)比例的待測(cè)抗體(CD68、F4/80)，混勻后室溫避光孵育30 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清液。加PBS洗5 min×3次，棄上清液。加0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CD68+F4/80+細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽癌患者血清及腫瘤組織IL-33水平 ELISA結(jié)果顯示，鼻咽癌患者血清IL-33水平[(287.1±38.4)ng/L]明顯高于鼻咽黏膜慢性炎癥患者[(123.8±25.0)ng/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，鼻咽癌患者腫瘤組織IL-33水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2IL-33對(duì)鼻咽癌細(xì)胞干性的影響 成球試驗(yàn)顯示，重組IL-33蛋白能明顯增加5-8F與CNE-2細(xì)胞的成球數(shù)量與大小(P<0.05)。Real-time PCR與Western blot檢測(cè)顯示重組IL-33能明顯增加CNE-2細(xì)胞干性基因NANOG、NOTCH3與OCT3/4的mRNA及蛋白水平(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：IHC；B：ELISA；C:Western blot

圖1鼻咽癌患者血清及腫瘤組織IL-33水平情況

A、B、C：不同濃度重組IL-33(0～100 ng/mL)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞成球的影響；D、E：重組IL-33對(duì)干性基因NANOG、NOTCH3、OCT3/4 mRNA與蛋白水平的影響

圖2重組IL-33對(duì)鼻咽癌細(xì)胞干性的影響

A：重組IL-33(100 ng/mL)對(duì)CNE-2細(xì)胞ERK、MAPK、NF-κB、c-Jun信號(hào)通路的影響；B：JNK抑制劑SP600125抑制重組IL-33對(duì)CNE-2細(xì)胞干性基因的作用

圖3重組IL-33對(duì)鼻咽癌細(xì)胞信號(hào)通路的影響

2.3IL-33對(duì)鼻咽癌細(xì)胞信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)顯示，重組IL-33能明顯增加CNE-2細(xì)胞c-Jun的磷酸化水平(P<0.05)而不影響ERK、MAPK與NF-κB的磷酸化水平，使用JNK特異性抑制劑SP600125能明顯抑制重組IL-33對(duì)CNE-2細(xì)胞NANOG、NOTCH3與OCT3/4水平(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4小鼠模型的建立與分析 IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線與生存曲線均明顯差于對(duì)照小鼠(P<0.05)。Western blot檢測(cè)顯示IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤組織NANOG、NOTCH3、OCT3/4及磷酸化c-Jun水平均明顯高于對(duì)照小鼠(P<0.05)。流式分析顯示IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤組織中CD68+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照小鼠(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線；B：小鼠生存曲線；C：小鼠腫瘤組織干性基因與p-c-Jun水平分析；D：小鼠腫瘤組織流式分析

圖4IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠模型分析

3 討 論

鼻咽癌具有浸潤(rùn)性高、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-2]。目前，放射治療仍是治療鼻咽癌的首要方案[2]，但其療效尚不能令人滿意，鼻咽癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是患者的主要死因[2,13]。另外，放療在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)可能損傷周圍正常組織細(xì)胞，引發(fā)多種毒副作用，甚至導(dǎo)致治療中斷[14]。研究指出，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫監(jiān)視、免疫耐受和免疫逃逸等密切相關(guān)[15]。IL-33屬于IL-1家族成員，是一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子[8-9]。大量研究表明，IL-33在多種炎性疾病及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[9,11]。通過(guò)與其受體ST2結(jié)合，IL-33可誘導(dǎo)Th2型促炎因子和趨化因子的分泌[8]。報(bào)道指出，IL-33與其受體ST2水平對(duì)肝癌、乳腺癌、肺癌和大腸癌患者的病情進(jìn)展、診斷及預(yù)后具有重要參考價(jià)值[8,11]。目前尚無(wú)研究報(bào)道IL-33對(duì)鼻咽癌的作用。本研究的目的是探討IL-33對(duì)鼻咽癌的作用，并研究其潛在的分子機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者的血清IL-33水平明顯高于鼻咽黏膜慢性炎癥患者。同時(shí)，鼻咽癌患者腫瘤組織IL-33水平亦明顯高于癌旁正常組織。小鼠模型研究顯示，IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線與生存曲線均差于對(duì)照小鼠。這些結(jié)果提示IL-33可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的極少量腫瘤細(xì)胞，具有自我更新的能力和多向分化的潛能[6]。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)自提出以來(lái)，備受科學(xué)界的關(guān)注。因此，正確認(rèn)識(shí)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性和調(diào)控機(jī)制，尋找與腫瘤干性相關(guān)的因子或基因?qū)δ[瘤的治療至關(guān)重要。目前，已有多項(xiàng)報(bào)道指出，鼻咽癌中亦存在少量腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，是鼻咽癌形成、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[7,16]。本研究重組IL-33蛋白能明顯增加5-8F與CNE-2細(xì)胞的成球數(shù)量與大小，且重組IL-33能明顯增加CNE-2細(xì)胞干性相關(guān)基因NANOG、NOTCH3與OCT3/4的mRNA及蛋白水平。

巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞[3]。近年來(lái)，巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫中的作用日益受到人們重視。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能主動(dòng)抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中起重要作用[4-5]。JNK通路能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化[17]。多項(xiàng)研究指出，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞干性[4,18]。本研究中IL-33轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤組織中CD68+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照小鼠，提示IL-33可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)而影響腫瘤干性。另外，重組IL-33能明顯增加CNE-2細(xì)胞c-Jun的磷酸化水平，且使用JNK特異性抑制劑SP600125能明顯抑制重組IL-33對(duì)CNE-2細(xì)胞干性基因的影響。因此，IL-33可能通過(guò)巨噬細(xì)胞影響鼻咽癌細(xì)胞的c-Jun信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤干性。

綜上所述，本研究表明鼻咽癌患者的血清和腫瘤組織中IL-33水平均明顯升高，重組IL-33能通過(guò)c-Jun信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的干性，另外IL-33能介導(dǎo)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量的改變，IL-33可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤干性，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌的惡化。