甜菜葉片SPAD值和光合色素的相關性研究

郝學明，王響鈴，宋柏權，王孝純，王秋紅，周建朝

（黑龍江大學/黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室/黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris)是黎科甜菜屬作物，是世界上僅次于甘蔗的第二大重要的糖料作物[1]。甜菜糖占世界食糖產量的30%左右，在世界產糖大國中，中國是美國、日本、埃及、西班牙等少數既產甜菜糖又產甘蔗糖的國家之一[2]。中國甜菜種植主要分布在東北、西北和華北地區，在中國北方農業與制糖業發展和農民增收等方面具有不可代替的作用[3]。甜菜是一種糖料作物，光合作用是甜菜塊根產糖量形成的重要影響因素，甜菜塊根產量中90%～95%的有機質是由光合作用固定并轉化的[4]。植物光合利用率主要取決于葉片葉綠素含量的多少，可以通過測定葉片中的葉綠素含量來鑒定其營養狀況[5]。因此，測定甜菜葉綠素含量對分析甜菜葉片光合能力、預測甜菜塊根產糖有具有重要意義。

目前測定葉綠素含量的方法主要有2 種，一種是化學提取分光光度計比色法，另一種是SPAD(Soil and Plant Analyzer Development)葉綠素儀法[6]。SPAD-502葉綠素儀可快速測量植物葉片單位面積葉片當前葉綠素的相對含量，即SPAD值[7]。采用葉綠素儀測定葉片的SPAD值具有便攜、實時和對葉片無損的優點。在棉花[8]、小麥[9-10]、水稻[11-12]、油菜[13]等作物[14]及果樹[15]和園林樹木[16]中均有廣泛應用。研究表明，葉綠素在植株葉片中的分布會因物種、測定時期、測定位置的不同而異。不同植物及同一植物的不同品種利用SPAD值來預測葉片葉綠素含量均存在一定差異，同一植株葉片上的SPAD值表現出葉尖部＞葉中部＞葉基部的特點[17-18]。而分析甜菜葉片葉綠素含量與SPAD值相關性鮮見報道。

本文利用分光光度計和SPAD葉綠素儀測定不同甜菜品種的葉綠素含量，研究甜菜葉片的葉綠素含量和SPAD值的相關關系，確定適宜的SPAD值測定位置，旨在為SPAD-502葉綠素儀測定法計算甜菜葉片的葉綠素含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甜菜品種‘KWS1197’、‘KWS5145’、‘KWS0143’源于德國 KWS 公司，‘ВETA165’源于美國Вeta公司，4個品種均為二倍體遺傳單粒種。

水培用盆為聚乙烯塑料盆(24 cm× 17 cm×16 cm)，水培化學試劑同常規。

1.2 試驗設計

水培試驗于2018年4月4日—5月16日在國家糖料改良中心/黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室進行。將‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS5145’、‘KWS0143’甜菜種子播種于經過180℃高溫消毒4.5 h 的蛭石中，澆適量去離子水，進行催芽。1 周后（待甜菜子葉完全展開）4 個品種均選擇長勢一致的幼苗移入1/4全量營養液中培養。首先用1/4濃度全營養液培養1周，然后用1/2濃度全營養液培養5天，之后全量營養液培養25天進行收獲，期間營養液每5 天更換1 次。光照時間為7:30—19:30，每天光照12 h，通氣12 h。每品種種植 8 盆，每盆 2 株，共 32 盆，隨機區組排列。

1.3 測定指標和方法

1.3.1SPAD值的測定 使用SPAD-502型葉綠素計測定最新完全展開葉片的葉尖、葉中和葉基3 個部位的SPAD值，每部位讀取10個值，每片葉共30個值。

1.3.2 光合色素含量的測定 光合色素含量的提取采用乙醇法[19]，在測定SPAD值的葉片相應位置，即葉片的葉尖、葉中和葉基3 個部位分別用直徑10 mm 打孔器打孔，取3個圓形葉片，用分析天平稱重后放于25 mL試管，用10 mL95%乙醇避光浸泡24 h，浸泡過程中混勻多次，待葉片完全變白后進行比色。光合色素測定采用分光光度法，利用UV-8000A紫外分光光度計，用波長665、649、470 nm分別測量吸光度值，并換算為單位質量葉綠素含量，見公式(1)～(4)。

1.4 數據計算及統計方法

試驗數據處理以及部分圖表的制作和統計分別利用Excel 2010軟件和SPSS 22.0制作

2 結果與分析

2.1 甜菜品種間SPAD值差異分析

如圖 1～4 所示，4 個甜菜品種SPAD值存在差異，‘KWS1197’、‘ВETA165’、‘KWS0143’、‘KWS5145’葉片平均SPAD值 ，‘KWS1197’最大 ，‘KWS5145’最小。在同一品種葉片不同測定位置上，‘ВETA165’SPAD值表現出葉基＞葉中＞葉尖的特點，越靠近葉片基部，SPAD值越大。‘KWS0143’則表現出完全相反的特點，即葉尖＞葉中＞葉基，越靠近葉片基部，SPAD值越小。‘KWS1197’、‘KWS5145’2 個品種均是葉中值較小，‘KWS1197’葉片不同測定位置SPAD值趨于穩定。‘ВETA165’、‘ KWS1197’葉基部SPAD值最大，‘KWS5145’和‘KWS0143’則是葉尖SPAD值最大。總體比較甜菜葉片中部的SPAD值與平均值最為接近。SPAD值在甜菜葉片中的分布不僅與測定的位置（葉尖、葉中、葉基）有關，還與測定的甜菜品種有關。

圖1 ‘BETA165’葉片SPAD值

圖2 ‘KWS1197’葉片SPAD值

圖3 ‘KWS5145’葉片SPAD值

圖4 ‘KWS0143’葉片SPAD值

2.2 甜菜品種間葉綠素總含量差異分析

如圖5～9所示，同一葉片的葉綠素總含量，測量位置不同其含量也有差異。‘ВETA165’與‘KWS5145’趨勢一致，均是葉基＞葉中＞葉尖，不同測量位置差異顯著。‘KWS1197’葉尖、葉中、葉基葉綠素含量差異較小，趨于平穩。‘KWS0143’葉尖的葉綠素總含量最多，而越靠近葉基部含量越少，從葉尖到葉基含量從1.94 mg/g 下降到1.77 mg/g。而各品種在葉中的葉綠素含量最接近均值，具有一定的代表性，這一規律與不同測量位置的SPAD值一致。在甜菜品種之間葉綠素含量葉存在差異。葉片中葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量均表現一致的趨勢 ，‘ВETA165’ ＞‘KWS1197’ ＞‘KWS0143’ ＞‘KWS5145’，這與品種間SPAD值的表現趨勢類似。在甜菜葉片中，葉綠素a 含量較高，平均1.38 mg/g，占葉綠素總含量的73%，其次為葉綠素b，而葉片中類胡蘿卜素含量較低，平均0.25 mg/g。甜菜葉片中葉綠素含量的分布規律與SPAD值一致，不僅與測定的位置（葉尖、葉中、葉基）有關，而且與測定的甜菜品種有關。

圖5 ‘BETA165’葉片不同部位葉綠素總含量

圖6 ‘KWS1197’葉片不同部位葉綠素總含量

圖7 ‘KWS5145’葉片不同部位葉綠素總含量

圖8‘KWS0143’葉片不同部位葉綠素總含量

圖9 甜菜不同品種葉片葉綠素含量

2.3 甜菜葉片SPAD值及葉綠素含量相關性分析

如圖10所示，甜菜葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜含量與SPAD值做回歸統計分析。甜菜光合色素含量與SPAD值呈正向相關。葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總含量及類胡蘿卜素含量的相關系數分別為0.7208、0.7763、0.7766、0.5704。

圖10 甜菜SPAD值與光合色素含量的相關性

不同品種甜菜葉片中光合色素含量和SPAD值均有差異，但是品種之間葉片的SPAD值與光合色素含量的變化趨勢整體上保持一致。總葉綠素含量與SPAD值的相關性最高，r=0.7766；葉綠素 a、b 含量與SPAD值的相關性次之；類胡蘿卜素與SPAD值的相關性最低，r=0.5704。

3 結論與討論

采用葉綠素儀測定葉片的SPAD值具有便攜、實時和對葉片無損的優點。尤其在大田條件下SPAD-502葉綠素儀可在無損狀況下幾秒鐘內測量植物葉片單位面積葉片當前葉綠素的相對含量，大大提高了效率。SPAD值與葉綠素含量相關性研究在其他作物上已有大量報道[20]，但在甜菜葉片及葉片上適宜的測量部位的研究涉及較少。本試驗探討了甜菜葉片上不同測量部位的SPAD值及相應的葉綠素含量，確定了SPAD值與葉綠素含量的相關性及適宜的測量部位，以便更加準確快速地反映甜菜葉片的葉綠素含量。

在甜菜葉片中，不同品種的SPAD值及葉綠素含量在測量位置上存在差異，‘ВETA165’、‘KWS1197’在葉基部葉綠素含量較高，葉尖較低，而‘KWS5145’、‘KWS0143’在葉尖部葉綠素含量較高，葉基部較低。研究結果表明，甜菜葉片的葉中部最接近平均值，因此，在測定甜菜葉片葉綠素含量與SPAD值時，選取葉中部進行測定具有一定的參考意義。陳琴等[15]對牧草的研究發現，葉中部的SPAD值更接近平均值，可以作為試驗牧草SPAD值測定的適宜部位，與本試驗結果一致。研究發現甜菜4～6片真葉期后最高葉片的葉片尖部可作為甜菜葉片SPAD值的最適測定部位[21]。潘義宏等[17]對煙葉的研究發現，采用葉綠素儀來測定葉片最佳部位會因品種而異。葉綠素含量在葉片3個部位存在差異可能是植物葉肉組織成熟程度的差異造成的。SPAD值會受到不同品種、不同測定時間、不同的生長環境等因素的影響[6,22-23]。

筆者使用SPAD-502 葉綠素儀測定葉綠素的相對含量，分光光度法測定葉綠素絕對含量，通過對甜菜SPAD值與葉綠素含量比較發現，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素及SPAD值在不同甜菜品種間有一定的差異。同時在甜菜葉片中葉綠素a 含量＞葉綠素b 含量＞類胡蘿卜素含量。這一結果與其他研究結果一致[24]。對葉綠素含量與SPAD值進行相關分析發現，SPAD值與葉綠素含量呈正相關，這一結果與水稻、小麥等作物[25]及綠色蔬菜[26]、果樹[27]等的研究結果相似。其中總葉綠素含量與SPAD值的相關性最高，r=0.7766，葉綠素a、b含量與SPAD值的相關性次之，而類胡蘿卜素與SPAD值的相關性最低，r=0.5704。

綜上所述，通過SPAD值來預測甜菜葉片葉綠素的絕對含量是可行的，為葉綠素的快速測定提供了便利，但是SPAD值會受到多種因素的影響，代表的是葉綠素的相對水平，在實際生產中若是要求植株確切的葉綠素含量，還需用傳統的分光光度法。而本試驗的甜菜品種較少，若測定不同品系的多個甜菜品種其相關性會更加精確。對于SPAD值和不同品種甜菜氮含量、產量、含糖量的關系還待于下一步研究。