組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA對(duì)小鼠T淋巴瘤細(xì)胞EL4中miR-150表達(dá)及增殖的影響

肖剛峰 任富鵬

非特指型外周T細(xì)胞淋巴瘤是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的淋巴系統(tǒng)惡性疾病，是常見的非霍奇金淋巴瘤亞型。其治療進(jìn)展緩慢，預(yù)后較差。非特指型外周T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未得到完全闡明。miR-150作為腫瘤抑制miRNA在多種惡性腫瘤中發(fā)生異常表達(dá)，介導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[1]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)miR-150在T細(xì)胞淋巴瘤低表達(dá)[2]，但其低表達(dá)的原因尚不清楚。最新研究資料揭示，表觀遺傳可調(diào)控microRNA表達(dá)，且乙酰化修飾是重要的表觀遺傳修飾方式之一[3-4]。我們推測(cè)表觀遺傳機(jī)制中的組蛋白去乙酰化酶的激活可能是抑制microRNA表達(dá)的原因，且研究亦發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）作為新型抗腫瘤藥物在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用。辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是第二代氧肟酸類HDACi，本研究探討HDACi SAHA對(duì)小鼠T淋巴瘤細(xì)胞EL4中miR-150表達(dá)的影響，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料 小鼠淋巴瘤細(xì)胞（EL4）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；1640培養(yǎng)液購(gòu)于GIBCO公司。胎牛血清購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生物工程研究所。SAHA購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit購(gòu)自Applied Biosystems公司。miR-150引物、U6引物由Primer 5.0設(shè)計(jì)并購(gòu)自上海百力格生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng) EL4細(xì)胞，條件為5%CO2，37℃。

1.2.2 SAHA處理EL4細(xì)胞 將5×105/ml EL4細(xì)胞接種于6孔板各孔中，細(xì)胞進(jìn)行無血清同步化處理后加入0.25、0.5、1μmol/L SAHA 孵育 32h。將 SAHA 處理過的EL4細(xì)胞洗脫、離心，定量 RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平。

1.2.3 定量RT-PCR測(cè)定細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，分管光度計(jì)測(cè)定濃度。分別通過miR-150和U6特異性引物，利用Taq－ManMicroRNA Reverse Transcription Kit合成 cDNA，進(jìn)行 qRT-PCR（ABIPRISM 7000 Sequence Detection System）。反應(yīng)條件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；40 個(gè)循環(huán)；軟件分析其Ct值，以U6作為內(nèi)參，由公式2-ΔCt計(jì)算miR-150在各組EL4細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力 收集各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。再將等量細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板,每孔加 MTT（5g·L-1）10μl，培養(yǎng) 4h 后,吸棄上清液,再加入 DMSO（150μl），于微量振蕩器充分振蕩 10min,置酶標(biāo)儀上于490nm處測(cè)吸光度（OD值）。各組細(xì)胞的增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞miR-150相對(duì)表達(dá)量比較 見表1、圖1。

表1 4組細(xì)胞m i R-150相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 4組細(xì)胞m i R-150相對(duì)表達(dá)量比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

由表1、圖1可見，在使用HDACi SAHA來處理EL4細(xì)胞后，EL4細(xì)胞中miR-150的表達(dá)增加（均P＜0.05），且隨著SAHA劑量的增加而增加。

2.2 4組細(xì)胞增殖情況比較 見表2、圖2。

表2 4組細(xì)胞增殖情況比較

圖2 4組細(xì)胞增殖情況比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

由表2、圖2可見，在使用HDACi SAHA來處理EL4細(xì)胞后，EL4細(xì)胞增殖能力下降（均P＜0.05）。

3 討論

非特指型外周T細(xì)胞淋巴瘤是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的T細(xì)胞惡性腫瘤，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。積極探索本病的發(fā)病機(jī)制，不僅具有重要的理論意義，而且可能為本病的診斷與治療提供新的策略。miRNA是一類非蛋白編碼小分子RNA，根據(jù)其在T淋巴細(xì)胞分化以及B細(xì)胞淋巴瘤的研究成果[5-7]，可以推測(cè)miRNA在外周T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要的作用。miR-150是長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，參與免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)發(fā)生、胚胎發(fā)育以及干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)[8-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-150作為腫瘤抑制性microRNA參與包括外周T細(xì)胞淋巴瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。在淋巴及造血系統(tǒng)惡性腫瘤中，其多為低表達(dá)。作為腫瘤抑制物，miR-150的低表達(dá)使得細(xì)胞分化凋亡異常，參與了惡性淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。

HDACi是一類具有抗腫瘤活性的新型藥物，研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外均有抗腫瘤作用，目前已應(yīng)用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤[13-14]。其抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不十分清楚，存在許多問題尚待進(jìn)一步闡明。我們推測(cè)其可能通過恢復(fù)或提高關(guān)鍵腫瘤抑制因子如miR-150等表達(dá)來起作用。為此，我們使用HDACi SAHA來處理小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EL4細(xì)胞miR-150的表達(dá)隨著SAHA劑量的增加而增加，表明miR-150的表達(dá)可能受到乙酰化修飾的調(diào)控，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。比如可以通過分析組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）與組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）的變化，同時(shí)結(jié)合阻斷策略來檢測(cè)miR-150的表達(dá)變化，間接驗(yàn)證對(duì)miR-150的調(diào)控影響。其次，可以用免疫共沉淀技術(shù)等方法來直接驗(yàn)證與miR-150的關(guān)系，以明確miR-150乙酰化修飾調(diào)控的具體機(jī)制。在本研究中，我們同時(shí)進(jìn)一步對(duì)經(jīng)HDACi SAHA處理后的EL4細(xì)胞增殖能力進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HDACi SAHA處理后，EL4細(xì)胞增殖能力下降，SAHA抗增殖能力呈劑量依賴可能。HDACi下調(diào)EL4細(xì)胞的增殖能力，我們推測(cè)其部分機(jī)制可能是通過恢復(fù)或提高miR-150的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究提示，SAHA作為HDACi能夠恢復(fù)或提高miR-150的表達(dá)并有效抑制小鼠T淋巴瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了對(duì)HDACi作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為SAHA應(yīng)用于非特指型外周T細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。