人參皂苷Rh2對慢性不可預知應激所致抑郁小鼠的治療作用及機制研究

方玲 楊莉莉

抑郁癥是一種常見的情感精神障礙，嚴重患者可出現自殺念頭。隨著生活節奏的加快，人們工作和生活壓力的增加，抑郁癥發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。目前關于抑郁癥的發病機制尚未十分清楚，有研究認為慢性應激與抑郁癥的發生關系密切。海馬在學習記憶、情緒、行為等調節中具有重要作用，是應激反應的調節中樞；而慢性應激易損傷海馬組織并引起海馬結構功能發生變化[3]。神經炎癥在抑郁癥的發生過程中也發揮著重要作用，抑郁癥患者神經炎癥因子水平往往升高[4]。目前抑郁癥的治療手段主要有抗抑郁藥物治療、物理治療、心理治療、中醫治療等，其中抗抑郁藥物治療是最主要的方法，但存在藥物價格昂貴、患者易復發、不良反應較為嚴重、靶點單一、依從性差等問題[5-6]。人參皂苷Rh2是從人參中分離出來的單體，其藥理作用廣泛，在治療惡性腫瘤、子宮內膜異位癥、哮喘以及改善心肌缺血、調節免疫功能、抗過敏、抗輻射、抗抑郁等方面都有一定作用[7-11]。本研究通過建立抑郁小鼠模型來觀察人參皂苷Rh2對小鼠抑郁行為、神經元發生及神經炎癥的影響，并探討人參皂苷Rh2治療抑郁癥的可能機制。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 健康、清潔級、雄性、22~26g、10~12周齡、C57BL/6J的小鼠100只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。人參皂苷Rh2（上海順博生物工程有限公司）；PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白裂解液、SP檢測試劑盒、RNA提取試劑盒等（美國 Gibco公司）；NF-κB p65、TNF-α、IL-1β（上海生工生物有限公司合成）；Trizol試劑、多聚甲醛、結晶紫溶液、山羊血清、一抗、二抗等（美國Sigma公司）。

1.2 動物分組與處理 將100只小鼠隨機分為對照組、模型組、Rh2低劑量組、Rh2中劑量組、Rh2高劑量組，每組20只。模型組、Rh2低劑量組、Rh2中劑量組、Rh2高劑量組小鼠建立慢性應激所致抑郁模型，應激源包括2次5min游泳、2次6h飲水剝奪、1次30min懸尾、2次徹夜光照、3次10min閃光、1次17h濕籠、1次17h空籠無墊料、1次17h合籠、2次14h食物剝奪、1次2h合籠，以不可預知方式隨機組合實施，每天實施2種應激源，持續10周；對照組小鼠不給予應激。從應激處理第3周開始，Rh2低、中、高劑量組小鼠分別給予5、10、40mg/（kg·d）的人參皂苷Rh2（溶于0.2ml蒸餾水中）灌胃，1次/d；對照組、模型組小鼠每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.3 小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比測定第10周應激處理結束后，測定小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比。（1）懸尾測試實驗：固定小鼠遠端尾部1.5cm處，鼠頭向下、距離地面35cm懸掛，測定360s內小鼠懸掛時靜止不動的時間百分比。（2）強迫游泳實驗：在直徑25cm、高30cm透明玻璃水缸中注入15cm高的水，將小鼠放入水中，水溫21~25℃，記錄360s內小鼠輕微肢體活動或漂浮不動的時間百分比。

1.4 標本采集 懸尾測試、強迫游泳實驗結束后，每組取10只小鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后打開小鼠腹腔、暴露心臟，200ml PBS灌流，多聚甲醛灌流固定；斷頭取腦、分離腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，取4μm冠狀腦組織切片用于免疫組化染色。每組剩余10只小鼠快速斷頭處死，冰上分離海馬組織，液氮中速凍，用于RT-PCR和Western blot實驗。

1.5 小鼠海馬區5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和神經元核抗原（NeuN）表達情況檢測 采用免疫組化染色法。（1）BrdU表達檢測：小鼠腦組織切片用PBS洗滌，HCl孵育30min；硼酸緩沖液洗滌，PBS洗滌，H2O2孵育10min；PBS洗滌，山羊血清封閉45min。加入小鼠抗BrdU抗體過夜孵育；PBS洗滌，加入抗小鼠二抗孵育。陰性對照以PBS代替一抗，PBS洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封固。采用體視學方法分析BrdU免疫組化染色結果，觀察并統計BrdU陽性細胞數。（2）NeuN表達檢測：小鼠腦組織切片用PBS洗滌，加入Tritonx-100孵育30min；PBS 洗滌，H2O2室溫孵育 10min；PBS 洗滌，山羊血清封閉45min。加入小鼠抗NeuN抗體過夜孵育；PBS洗滌，加入抗小鼠二抗。陰性對照以PBS代替一抗，PBS洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封固。采用Carl Zeiss Axio Vision Rel.4.6圖像分析系統分析NeuN免疫組化染色圖像，NeuN表達量以灰度值表示，灰度值越大表示NeuN表達量越少。

1.6 小鼠海馬區 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 表達水平測定 采用RT-PCR法。取約100mg小鼠海馬組織，加入裂解液，勻漿器勻漿后提取總RNA；取1μg RNA反轉錄獲得海馬組織cDNA，以cDNA為模板進行PCR，以β-actin為內參照，反應條件：94℃ 5min；94℃30s、55℃ 30s、72℃ 30s，共 40 個循環；72℃ 10min。NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達量以 2-ΔΔCT表示。

1.7 小鼠海馬區 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平測定 采用Western blot法。取小鼠海馬組織50mg，加入裂解液提取海馬組織總蛋白，BCA法測定海馬組織總蛋白濃度。制備電泳凝膠，每孔加入10μl上樣液進行電泳分離，將得到的目的蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，加入 NF-κB p65 抗體（1∶1 000 稀釋）、TNF-α 抗體（1∶200稀釋）、IL-1β 抗體（1∶200稀釋）、β-actin抗體（1∶5 000稀釋）過夜孵育，加入二抗（1∶5 000稀釋）孵育2h。采用Tanon-4200凝膠成像系統對結果進行分析，NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平以 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值的比值表示。

1.8 統計學處理 應用SPSS 20.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比比較5組小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比均明顯增加（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠懸尾不動、強迫游泳不動時間百分比均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組有所降低但差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 1。

2.2 5組小鼠海馬區BrdU和NeuN表達情況比較 免疫組化染色顯示，BrdU陽性細胞散在或成簇分布在齒狀回顆粒下區，呈梭形或圓形，見圖1；NeuN陽性細胞廣泛密集分布在海馬區，見圖2。5組小鼠海馬區BrdU陽性細胞數和NeuN灰度值比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組小鼠海馬區BrdU陽性細胞數明顯減少（P＜0.05），NeuN灰度值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區BrdU陽性細胞數均明顯增加（均P＜0.05），NeuN灰度值均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組小鼠海馬區BrdU陽性細胞數和NeuN灰度值變化均不明顯（均P＞0.05），見表2。

圖1 5組小鼠海馬區BrdU免疫組化染色所見（a：對照組；b：模型組；c：Rh2低劑量組；d：Rh2中劑量組；e：Rh2高劑量組；×200）

圖2 5組小鼠海馬區NeuN免疫組化染色所見（a：對照組；b：模型組；c：Rh2低劑量組；d：Rh2中劑量組；e：Rh2高劑量組；×25）

2.3 5 組小鼠海馬區 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平比較 5組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1βmRNA表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 表達水平均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組有所降低但差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表 3 5 組小鼠海馬區 N F-κB p65、T N F-α、I L-1β m R NA表達水平比較

2.4 5 組小鼠海馬區 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達水平比較 5組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達水平均明顯降低（均P＜0.05），Rh2低劑量組有所降低但差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖3和表4。

3 討論

有研究發現人參皂苷Rh2可改善結腸癌模型小鼠的抑郁行為，降低抑郁相關細胞因子水平，同時認為人參皂苷Rh2可能通過降低抑郁相關細胞因子水平來發揮抗抑郁作用[12]。本文通過慢性不可預知應激建立抑郁小鼠模型并給予人參皂苷Rh2治療，結果發現人參皂苷Rh2中、高劑量均可有效改善抑郁小鼠的懸尾不動和強迫游泳不動時間百分比，筆者認為人參皂苷Rh2能抑制小鼠的抑郁行為，且可能呈劑量依賴性。

圖 3 5組小鼠海馬區N F-κB p65、T N F-α、I L-1β蛋白表達的電泳圖（a：對照組；b：模型組；c：R h2 低劑量組；d：R h2 中劑量組；e：R h2高劑量組）

表 4 5 組小鼠海馬區 N F-κB p65、T N F-α、I L-1β蛋白表達水平比較

成年動物的海馬組織每天會生成大量新神經元，而海馬齒狀回終生具有生成新神經元的能力。齒狀回是海馬組織的重要信息傳入通路，齒狀回新生的神經元對學習記憶功能具有重要作用。成年動物的海馬神經干細胞分布在海馬齒狀回顆粒細胞及亞顆粒區的最內層，海馬神經干細胞產生的新生細胞可以分化為神經元。近年來研究發現，神經發生障礙與抑郁癥的發病關系密切，是抑郁癥的發病基礎之一，抗抑郁藥可通過增加海馬區神經發生來發揮抗抑郁的作用[13]。NeuN在成熟神經元中特異表達，而BrdU在細胞中永久存在，可用于標記處于DNA合成器的齒狀回先祖細胞，NeuN和BrdU標記的陽性神經元變化可反映神經細胞增殖和分化情況[14-15]。本研究結果發現，抑郁模型小鼠海馬區NeuN表達下降（NeuN灰度值升高）、BrdU陽性細胞數減少，表明抑郁可引起小鼠海馬神經元損傷及神經發生減少；而人參皂苷Rh2中、高劑量治療可增加抑郁小鼠海馬區NeuN表達及BrdU陽性細胞數。分析原因，筆者認為人參皂苷Rh2可能通過促進抑郁癥小鼠海馬神經元成熟和神經發生、恢復海馬組織的結構和功能來發揮抗抑郁作用。

細胞因子對應激反應、免疫反應、炎癥反應等具有調節作用，抑郁癥患者的生理和心理應答與細胞因子的中樞效應關系密切，多種炎癥介質及細胞因子等活性分子水平的改變與抑郁癥的發生有關。在抑郁癥的發生過程中，抑郁、焦慮等負面情緒可引起下丘腦、垂體、腎上腺軸負反饋失調，引起機體免疫功能異常[16]。NF-κB蛋白家族在中樞神經系統中廣泛分布，NF-κB為早期轉錄因子，參與包括TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的生成。腦內TNF-α、IL-1β等一系列炎癥細胞因子水平增加，可引起神經細胞損傷[17-19]。本研究結果發現，抑郁模型小鼠海馬組織 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 水平升高。慢性應激能激活海馬組織NF-κB，增加NF-κB表達水平，而NF-κB水平升高又進一步上調TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子水平，從而引起海馬神經元損傷；而人參皂苷 Rh2治療可降低海馬組織 NF-κB、TNF-α、IL-1β水平。故筆者認為，人參皂苷Rh2對抑郁癥的治療作用可能與人參皂苷Rh2抑制NF-κB信號通路，降低海馬組織TNF-α、IL-1β水平有關。

綜上所述，人參皂苷Rh2對抑郁癥小鼠具有治療作用，其作用機制可能是人參皂苷Rh2可促進海馬神經元成熟和神經發生，并通過抑制NF-κB信號通路降低海馬組織炎性反應來發揮抗抑郁作用。