基于高通量測序技術研究老年人腸道菌群結構變化*

余 莉 李 紅 王思平

中國人民解放軍總醫院健康管理研究院國賓二科(100853)

背景：隨著我國人口的老齡化，老年人的健康保健備受關注。目的：探討增齡對腸道菌群結構的影響，以期通過調節腸道微生態提升老年人健康水平。方法：收集30例健康老年人(60～80歲)和10例健康青年人(18～40歲)的糞便樣本，采用高通量測序技術測定所有糞便細菌的16S rRNA基因V3、V4區序列，使用MiSeq 16S宏基因組APP和Qimme軟件分析菌群物種分類、物種多樣性指數、樣本組間顯著性差異和各組生物學標志物。結果：老年健康組與青年健康組腸道菌群OTU均數接近，物種多樣性相似(P>0.05)。Metastats分析顯示，在菌門水平上，兩組間優勢菌門擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)差異均無統計學意義(P>0.05)。在菌屬水平上，兩組間共有20余種菌屬差異有統計學意義(P<0.05)。老年健康組八疊球菌屬(Sarcina)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Olsenella、Rheinheimera、Terrisporobacter、食酸菌屬(Acidovorax)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae_UCG-003)、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、Gelria、Aquabacterium、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、Caldicoprobacter、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Turicibacter豐度顯著增高，青年健康組厭氧乙酸屬(Acetanaerobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae_UCG-009)、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、糞球菌屬_2(Coprococcus_2)豐度顯著增高。LEfSe分析顯示，老年健康組生物學標志物富集于食酸菌屬、纏結優桿菌(Eubacterium_nodatum_group)、梭菌科_1(Clostridiaceae_1)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)，青年健康組則富集于普氏菌屬_2(Prevotella_2)、羅氏菌屬(Roseburia)、厭氧乙酸屬。結論：隨著年齡的增長，腸道菌群結構和功能發生一定程度的改變。老年人產丁酸鹽細菌明顯減少，同時機會致病菌增多。

近年來，隨著分子生物學的發展，被譽為人類“第二基因組”的腸道菌群成為研究熱點。越來越多的研究表明，腸道菌群結構和功能的改變與代謝性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病、精神疾病、神經退行性疾病、消化道腫瘤等的發生、發展之間存在關聯。影響腸道菌群結構的因素主要有性別、年齡、宿主遺傳背景、環境、食物、抗菌藥物等[1]。我國是世界上60歲以上老年人最多的國家[2]，據國家統計局年度調查(2011)和《中國老齡事業發展報告(2013)》，我國已全面進入人口老齡化社會，老年人的健康保健和醫療成為全社會關注的焦點，預防衰老相關疾病，改善老年人健康是亟待解決的社會問題。本研究主要探討增齡對腸道菌群結構的影響，以期通過調節腸道微生態為提升老年人健康水平提供新思路。

對象與方法

一、研究對象

連續收集2016年1月—2018年1月在中國人民解放軍總醫院健康管理研究院進行健康體檢、檢查項目包括常規結腸鏡檢查的個體。納入標準：①年齡18～40歲或60～80歲；②結腸鏡檢查結果提示未見異常；③體力狀況ECOG評分0～2，依從性良好；④簽署知情同意書。排除標準：①腫瘤和放化療患者；②近1個月服用過微生態制劑(益生菌、益生元、合生元)、深海魚油制劑(omega-3)、抗氧化劑(維生素A、C、E)；③肝腎功能異常和胰腺疾病；④自身免疫性疾病，近3個月服用過非甾體消炎藥、免疫抑制劑、糖皮質激素；⑤嚴重心腦血管疾病、糖尿病、高脂血癥；⑥肥胖(體質指數>28 kg/m2)；⑦活動性炎癥性腸病、結直腸息肉；⑧近1個月內感染、使用抗菌藥物；⑨近1個月服用過聚乙二醇等導瀉劑；⑩慢性便秘、急慢性腹瀉。入組患者根據年齡分為老年健康組(60～80歲)和青年健康組(18～40歲)。

二、方法

受檢者于結腸鏡檢查前留取糞便標本，通過篩選納入研究者以高通量測序技術(FloraCheckTM，蘇州艾達康醫療科技有限公司)測定所有糞便細菌的16S rRNA基因V3、V4高可變區序列，使用MiSeq 16S宏基因組APP和Qimme軟件分析菌群物種分類、物種多樣性指數、樣本組間顯著性差異和各組生物學標志物，獲得老年健康組與青年健康組腸道菌群組成及其活性信息。

1. OTU(operational taxonomic units, 運算分類單元)分析和物種注釋：OTU是一個人為設置的分類單元，根據測序結果，將相似性>97%者歸為一個OTU。以韋恩圖表示兩組特有或共有的OTU個數。將總OTU與數據庫比對，對物種在不同分類水平上進行注釋，以profiling柱狀圖表示兩組物種的相對豐度。

2. α多樣性分析：基于OTU分析結果，可反映菌群豐度和多樣性，包括chao1、observed-species、PD-whole-tree和shannon四個指數，其中chao1常用于評估物種總數，shannon用于估算樣本微生物多樣性，本研究應用這兩個指數進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3. β多樣性分析：用于比較樣本在物種多樣性方面的差異。本研究采用主坐標分析(principal coordinates analysis, PCoA)比較樣本間菌群組成的差異，以二維坐標圖呈現。坐標圖上兩點距離越近，樣本組成越相似；兩點距離越遠，樣本組成相似度越低。

4. 差異性分析：采用Metastats檢驗對物種組成差異有統計學意義的組別從菌門、菌屬水平進行菌群分析，P<0.05為差異有統計學意義。

5. LEfSe分析：LEfSe采用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)估算每組物種豐度對差異效果影響的大小，找出顯著差異性的群落或物種，即宏基因組生物學標志物(biomarker)。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況

共40例健康成人納入研究，其中老年健康組30例，青年健康組10例。老年健康組男性15例，女性15例，平均年齡(67.0±4.6)歲，體質指數(BMI)(22.72±1.69) kg/m2；青年健康組男性6例，女性4例，平均年齡(31.7±5.9)歲，BMI(22.44±2.14) kg/m2。兩組間性別(χ2=0.033,P=0.855)和BMI(t=0.429,P=0.670)差異無統計學意義，年齡差異有統計學意義(t=19.519,P=0.001)。

二、生物信息學分析

1. OTU和豐度分析：老年健康組OTU個數為4 791條，青年健康組為3 472條(圖1)。根據物種注釋結果，各樣本物種在不同分類等級中組成柱狀圖，可見各樣本豐度較高的物種及其比例(圖2)。

2. α多樣性分析：chao1、shannon指數分析圖中，老年健康組與青年健康組OTU均數接近，兩組物種多樣性相似，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。

3. β多樣性分析：在屬水平上對老年健康組和青年健康組進行PCoA分析，結果顯示主成分1和2無法將兩組有效區分，主成分1可解釋兩組差異的8.6%，主成分2可解釋兩組差異的6.51%(圖4)。

4. 老年健康組和青年健康組注釋、主成分分布：將總OTU與數據庫比對，對物種在不同分類水平上進行注釋，作物種profiling柱狀圖，縱坐標表示相對豐度，不同顏色對應不同物種名稱，色塊長度表示該物種的相對豐度比例。此步驟主要在門、屬水平進行分析。

①門水平：兩組樣本共包含14個門，所有樣本的優勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。老年健康組豐度最高的4個門依次為：擬桿菌門53.8%，厚壁菌門34.0%，變形菌門9.1%，放線菌門(Actinobacteria) 2.0%；而青年健康組分別為：擬桿菌門63.1%，厚壁菌門32.0%，變形菌門3.4%，放線菌門0.7%(圖5)。Metastats分析顯示兩組間四個菌門差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖1 老年健康組(A)和青年健康組(B)基于OTU的韋恩圖

圖2 老年健康組(A)和青年健康組(B)各樣本在屬水平上的物種相對豐度

②屬水平：老年健康組優勢菌屬大都屬于擬桿菌門，菌屬豐度依次為：擬桿菌屬(Bacteroides)34.9%，普氏菌屬_9(Prevotella_9)11.3%，糞桿菌屬(Faecalibacterium)4.5%，埃希菌屬(Escherichia-Shigella)1.7%，薩特菌屬(Sutterella)1.7%，Alistipes1.5%；青年健康組優勢菌屬同樣大都屬于擬桿菌門，菌屬豐度依次為：擬桿菌屬32.6%，普氏菌屬_9 19.1%，糞桿菌屬4.4%，普氏菌屬_2 3.8%，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)1.7%，Parasutterella1.7%，Alistipes1.4%(圖6)。Metastats分析顯示，在菌屬水平上，兩組間共有20余種菌屬差異有統計學意義(P<0.05)。老年健康組八疊球菌屬(Sarcina)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Olsenella、Rheinheimera、Terrisporobacter、食酸菌屬(Acidovorax)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae_UCG-003)、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、Gelria、Aqua-bacterium、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、Caldico-probacter、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Turicibacter豐度顯著增高，青年健康組厭氧乙酸屬(Acetanaero-bacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae_UCG-009)、草酸桿菌屬(Oxalo-bacter)、糞球菌屬_2(Coprococcus_2)豐度顯著增高。

圖3 老年健康組(A)和青年健康組(B)α多樣性分析

圖4 老年健康組(A)和青年健康組(B)β多樣性分析

圖5 老年健康組(A)和青年健康組(B)樣本菌群在門水平上的主成分

5. LEfSe分析：以LEfSe分析尋找有顯著差異性的菌屬，即宏基因組生物學標志物，結果顯示老年健康組生物學標志物富集于食酸菌屬、厚壁菌門的纏結優桿菌(Eubacterium_nodatum_group)和梭菌科_1(Clostridiaceae_1)、變形桿菌門的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)；青年健康組生物學標志物富集于普氏菌屬_2、羅氏菌屬(Roseburia)、 厭氧乙酸屬(圖7)。

討 論

2010年和2011年，Biagi等[3]和Claesson等[4]分別發表了關于意大利和愛爾蘭老年人腸道菌群的研究，是衰老腸道菌群研究領域中兩個標志性、引領性的研究。人體腸道菌群直至2～3歲才近似成人并趨于穩定。影響腸道菌群的因素包括遺傳、種族、年齡、生活和飲食習慣、環境等，其中宿主遺傳背景對腸道菌群結構的貢獻率僅為1.9%，環境因素在腸道菌群的形成過程中起決定性作用[5]。老年人飲食結構的改變以及腸道蠕動功能下降，導致腸道屏障功能減弱，腸黏膜通透性增加，腸道微生態發生一定程度的變化。研究發現持續性低度炎癥是老齡和各種年齡相關疾病最一致的生物學特征之一[6]。最近證據表明，腸道菌群可能在老齡相關炎癥中起關鍵作用[7]。

圖6 老年健康組(A)和青年健康組(B)樣本菌群在屬水平上的主成分分布

本研究α多樣性分析顯示，老年健康組和青年健康組的OTU均數接近，兩組物種多樣性相似；β多樣性分析顯示，兩組物種主要成分組成接近。在物種分類水平上，擬桿菌門和厚壁菌門是腸道菌群的主要組成成分，本研究中兩組均為擬桿菌門占比最高，厚壁菌門/擬桿菌門比值在老年健康組和青年健康組分別為0.63和0.51，組間擬桿菌門和厚壁菌門豐度均無明顯差異。上述結果與既往對老年腸道菌群的研究結果有所不同。Odamaki等[8]的研究發現，腸道菌群豐度和多樣性隨年齡增長而降低，老年人群擬桿菌門和變形菌門豐度隨年齡增長而增加，厚壁菌門豐度則隨年齡增長呈降低趨勢。而Bian等[9]對中國健康人群的橫斷面研究顯示，老年健康人群的腸道總體微生物組成與青年健康人群相似，差異主要存在于與<20歲的人群比較時。各研究結果不同的原因可能在于：①不同國家、地區的研究對象，在種族、生活和飲食習慣等方面存在差異。②研究采用的測序方法不同。分子生物學技術常用的測序方法包括高通量測序、實時熒光定量PCR和PCR-梯度凝膠電泳，不同方法各有其優勢和局限性。③對老年人的定義不同，導致不同研究檢測人群中老年人的平均年齡存在較大差異。

本研究Metastats分析顯示，在菌屬水平，產丁酸鹽細菌在老年健康組與青年健康組間豐度差異較大，已鑒定出的產生丁酸鹽細菌瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和糞球菌屬[10]在青年健康組中明顯增多。丁酸鹽作為一種短鏈脂肪酸(SCFAs)，是結腸細胞的能量來源之一，并可通過細胞代謝、菌群穩態、抗增殖、免疫調節以及基因/表觀遺傳調控等機制發揮抗炎和抗腫瘤作用。對丁酸的機制研究表明其可促進結腸細胞凋亡；通過抑制組蛋白脫乙酰基酶調控基因表達，從而調節腸道屏障的完整性，降低腸道通透性；通過cAMP依賴性機制激活糖異生作用，從而有益于機體能量穩態[11-12]。青年健康組草酸桿菌屬豐度亦較高，其具有促進體內草酸排泄的作用，可調節宿主草酸穩態、預防草酸鈣腎結石形成以及其他草酸相關病理改變[13]。何方等的團隊分析了中國西南地區148例健康中老年人的腸道菌群，鑒定出的與年齡呈負相關的菌屬中包括草酸桿菌屬，同時發現衰老相關特定菌群與免疫老化之間可能存在關聯[14]。老年健康組糞芽孢菌屬和腸桿菌屬數量明顯增加。研究發現糞芽孢菌屬在慢性功能性便秘患者和結腸癌模型大鼠腸道中的豐度顯著增高，提示其可能為潛在致病菌[15-16]；而腸桿菌科在腸易激綜合征(IBS)患者腸道中的豐度較對照組顯著增高[17]。芽孢桿菌屬、腸桿菌屬等參與了腸道內未消化蛋白的發酵，此種細菌腐敗過程可能破壞腸道穩態，氨、腐胺等腐敗產物參與了結直腸癌的發生[18]。此外，老年健康組柔膜菌門的厭氧支原體屬、紅蝽菌科豐度顯著增高。在高脂飲食大鼠中，柔膜菌門被證明與肥胖相關代謝參數有關[19]。有研究[20]發現病態肥胖個體腸道菌群中紅蝽菌科豐度增高，但在胃旁路術后可恢復至正常體質量個體水平，提示該物種可能具有致代謝紊亂作用。予小鼠飲食中長期添加左旋肉堿，可見盲腸菌群結構發生改變，厭氧支原體屬數量增多并與參與動脈粥樣硬化形成的三甲胺-N-氧化物合成增加有關[21]。上述發現提示了年齡對腸道菌群結構和功能的影響，老年人腸道中機會致病菌增多。然而本研究未發現既往研究公認的具有促進健康作用的雙歧桿菌數量在老年健康組與青年健康組間存在顯著差異，與部分作者的研究發現相一致[22]。分析其原因可能與不同研究的受檢者來自不同地域、腸道菌群背景不同等因素有關。此外，產丁酸鹽糞桿菌屬以及與人體健康和代謝相關的Akkermansia在本研究老年健康組與青年健康組間亦無明顯差異，進一步提示了腸道菌群與宿主間關系的復雜性，特定微生物的作用應在具體腸道菌群背景之上進行分析。

本研究通過LEfSe分析發現老年健康組食酸菌屬、厚壁菌門的纏結優桿菌和梭菌科、變形桿菌門的叢毛單胞菌科富集。纏結優桿菌多見于口腔疾病患者[23]。近年對口腔菌群的研究發現，絕大部分口腔細菌可轉移并定植于結腸，尤其是機會致病菌，結直腸癌患者腸道富集菌種中有數個來源于口腔[24]。本研究中老年健康組纏結優桿菌富集在腸道衰老中的作用有待進一步明確。梭菌科是腸道正常優勢細菌，既包括有益菌也包括有害菌，有益梭菌主要有擬球梭菌亞群(Clostridiumcoccoidesgroup)和柔嫩梭菌亞群(Clostridiumleptumgroup)兩大亞群，而有害梭菌則以艱難梭菌(Clostridiumdifficile)為代表。本研究老年健康組梭菌科富集，具有差異性的糞芽孢菌屬數量增多，具有潛在致病可能。食酸菌屬對人體腸道功能以及健康和疾病的影響有待進一步研究。青年健康組產丁酸鹽羅氏菌屬富集，研究[25]證明產丁酸鹽羅氏菌屬數量減少是潰瘍性結腸炎患者腸道微生態失衡的特征之一。一項百歲老人腸道宏基因組學研究[26]顯示，與衰老相關的腸道微生物組特征為產SCFAs相關基因缺失、糖類分解能力下降和蛋白水解功能增強。在較年輕的老年人隊列中，同樣發現其產SCFAs功能降低[27]。上述發現表明青年人可能擁有更健康的腸道微生態。

綜上所述，本研究主要探討了老年人群與青年人群腸道菌群結構的差異，部分差異性菌群的代謝功能及其對宿主影響的作用機制尚需開展更多動物實驗加以證實。隨著年齡的增長，腸道菌群結構和功能發生一定程度的改變，表現為老年人產丁酸鹽細菌明顯減少，同時機會致病菌增多。調節和維持腸道微生物健康無疑是一種值得關注和探索的醫療策略，是促進老年人身體健康、改善其生活質量，進而緩解醫療壓力的研究方向。我國目前尚無大規模衰老人群的腸道菌群研究，本研究對年齡與腸道菌群結構變化的初步探索可為今后衰老腸道微生態的深入研究提供線索和參考。