UPLC-DAD 法快速檢測保健食品中13種非法添加化學物質

趙 琪，賈昌平，錢葉飛，陳麗波

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州215104）

保健食品是指一類具有特定保健功能的食品，供特定人群使用以調節機體，卻不能以治療疾病為目的［1］。緩解體力疲勞類保健食品中非法添加藥物最常見的是PDE-5抑制劑［2-3］，而近年來新的添加成分層出不窮，一些不法商販為了牟取暴利，在這類產品中添加化學藥品甚至是合成中間產物［4-5］，從而提高產品的療效，謀求暴利。這類非法添加的化學物質若長期使用，非但起不到強身健體的效果，甚至會損害人體健康［6］。

國家食品藥品監督管理局頒布的現行檢驗標準中涉及11種PDE-5選擇性抑制劑［7］，為規避檢查，不法生產者采取添加標準外的物質［8］，除西地那非的其他類似物之外，課題組在緩解體力疲勞類保健食品中首次檢出對乙酰氨基酚以及西地那非雜質12。對乙酰氨基酚是一類非甾體類抗炎藥，在臨床上用于抗炎鎮痛類化學藥品中［9］，且大劑量使用會存在一定的不良反應［10］。

目前，在緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學藥物的檢測中，液相色譜-串聯四級桿質譜法（HPLC-MS／MS法和UPLC-MS／MS 法）的應用較多［11-14］，但由于違禁成分添加量通常較大，容易導致質譜污染，檢測結果出現假陽性；以及原國標方法中的HPLC 法出峰慢、時間長、不利于快速定性、定量［15］。因此需建立一種高效檢測方法。本研究參考國家食品藥品監督管理局文件中規定的11種那非類化藥的檢測方法，使用UPLC 進行快速定性、定量。并做了方法學考察，最后使用該方法進行多批樣品檢測，以期實現此類非法添加化學藥物的快速篩查，為進一步的質譜確證提供有力的保障。

1 材料

1.1 儀器 KQ-300DA 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Synergy system 型超 純水儀（美國Millipore 公司）；TZL-5009型可調速漩渦混勻器；Heraeusbiofuge primor 型高速離心機（美國Thermo 公司）；Waters ACQuity UPLC 超高效液相色譜儀，配有2998型二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）。

1.2 試藥 實測樣品來自蘇州市食品藥品監督管理局抽檢樣品。

對照品鹽酸育亨賓（批號Y100800，含有量100%）購于（TRC 加拿大化工公司）；那紅地那非（批號1591-080A3，含有量99.2%）、紅地那非（批號1218-018A12，含有量99.1%）、伐地那非（批號1132-035A1，含有量99.5%）、豪莫西地那非（批 號1220-030A3，含有量98.7%）、氨基他達拉非（批 號1638-004A2，含有量99.9%）、他達拉非（批號1156-051A1，含有量99.7%）、硫代艾地那非（批號1214-006A3，含有量99.5%）、偽伐地那非（批號1217-011A2，含有量99.5%）、那莫西地那非（批號1320-054A2，含有量99.9%）、西地那非雜質12（批號2478-038A2，含有量99.1%）均購于（加拿大TLC Pharmachem 公司）；西地那非（批號510068-201401，含有量100.0%）、對乙酰氨基酚（批號100018-201610，含有量100%）均購于中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈和乙酸均為色譜純，其他試劑為分析純；實驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Luna UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相甲醇（A）-乙腈（B）-磷酸三乙胺溶液（C），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL／min；檢測波長200～400 nm；柱溫30 ℃；樣品室溫度室溫；進樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液

2.2.1.1 對照品貯備液 精密稱取那紅地那非及其相應的對照品約5 mg，置10 mL 量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度約為0.5 mg／mL 的對照品貯備液，于-20 ℃冰箱中保存。

2.2.1.2 混合對照品溶液 取“2.2.1.1”項下對照品貯備液（0.5 mg／mL）各100 μL 于5 mL 量瓶中，加乙腈定容至5 mL，混勻，即得13種對照品混合溶液。

2.2.1.3 檢出限溶液配制 取混合對照品溶液100 μL，置于5 mL 量瓶中，用磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（60 ∶20 ∶20）溶液定容至5 mL，作為檢出限溶液。

2.2.2 供試品溶液 取1次口服量樣品，研磨研細后，精密稱取細粉適量（約相當于1次服用量），置10 mL 量瓶中，加乙腈至10 mL，超聲20 min，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，于14 000 r／min 離心5 min，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液即得。

2.2.3 空白樣品溶液 不加樣品，按“2.2.2”項下方法制備空白樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液各適量，在“2.1”項條件下進樣0.5 μL。記錄色譜圖和各物質的紫外吸收光譜圖見圖1～2，從色譜圖中可以看出13種標準物質均達到基線分離。

圖1 各物質UPLC 色譜圖（230 nm）

2.4 線性關系考察 將上述“2.2.1”中配制好的混合對照品貯備液逐級稀釋 成2.5、5.0、10.0、25.0 μg／mL、50.0 μg／mL，將系列不同質量濃度的混合標準溶液進樣測定，記錄色譜圖，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性擬合，從而得到線性方程和相關系數。13種化合物的線性范圍為2.5～50.0 μg／mL。相關系數均在0.9990及以上，各分析物在各自范圍內線性關系良好，見表2。

2.5 定量、檢測限 分別精密量取“3.1”項下混合對照品溶液，用陰性樣品溶液等倍逐步稀釋，在“2.1”項條件下進樣1 μL，記錄峰高。當信噪比為10 ∶1時，得定量限；當信噪比為3 ∶1時，得檢測限，見表2。

表2 各對照品線性關系及檢出、定量限

2.6 精密度試驗 將混合對照品溶液在“2.1”項色譜條件下，連續進樣6次，測得各物質色譜峰面積RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

圖2 各對照品紫外吸收光譜圖（230 nm）

2.7 穩定性試驗 取質量濃度為50.0 μg／mL 的混合對照品溶液及供試品溶液（MAXMAN coffee），于自動進樣器中，分別于1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項條件下進樣，記錄峰面積，他達拉非峰面積的RSD 值小于2.0%。表明對照品溶液及供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（MAXMAN coffee）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，在“2.1”項條件下進樣，測得他達拉非峰面積RSD小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 以不含非法添加化學物質的緩解體力疲勞類保健食品為基質，在1個添加水平進行回收率測定，使回收率溶液最終質量濃度為2.5 μg／mL，平行制備6份，進樣，分析。得13種物質的平均加樣回收率在94.68%～115.30%之間，RSD 小于6%。

2.10 樣品含有量測定 按“3.2”項下方法處理樣品，在“2.1”色譜條件下進樣測定。本實驗選擇了市售及查獲的緩解體力疲勞類保健食品進行檢測，對實驗結果綜合保留時間及其光譜圖對樣品進行篩查，并通過外標法對檢出的化學成分定量。結果表明，4批檢出西地那非，1批檢出他達拉非，1批檢出氨基他達拉非，2批檢出西地那非雜質12，2批檢出對乙酰氨基酚，3批未檢出，陽性樣品均已通過UPLC-MS／MS 確證。見表3、圖3。

3 討論

3.1 色譜條件優化 原國標方法中甲醇-乙腈-0.7% 三乙胺水溶液20 ∶20 ∶60（磷酸調pH 至2.0），出峰快，那非類物質分離效果不佳。通過降低初始有機相比例，提高水相比例，將13種物質尤其是那非類出峰延后，達到了較好的分離效果。此外，水相添加劑的選擇考察了甲酸、乙酸，二者對于那非類分離效果不如0.7%三乙胺水溶液的洗脫性好，故水相仍沿用國標中0.7%三乙胺水溶液。

表3 樣品信息及測定結果

圖3 MAXMAN coffee UPLC 色譜圖（230 nm）

其次，色譜柱柱溫的高低會對緩解體力疲勞類非法添加化學物質的分離效能和分析速度產生影響。本實驗分別考察柱溫20、25、30、35、40 ℃的分離情況，20、25 ℃柱溫接近室溫，受室溫影響，溫度有可能會有波動，對分離效果改善也不理想；35、40 ℃對那非類的分離并沒有起到正向的作用，故最終確定柱溫30 ℃。

選擇了粒徑、長度相似的常規C18色譜柱，分別是Waters UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、LUNA UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）以及Agilent ZORBAX Eclipse plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。其中LUNA UPLC C18柱相較前兩者來說，在同樣的流動相比例及相同柱溫條件下，對于那非類化合物分離效果更好。

3.2 優勢和不足 本實驗所建立的方法適用于緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學物質的初步篩查，對陽性的結果還需進行質譜確證。由于質譜儀靈敏度高，在樣品前處理中容易導致交叉污染，故在實際檢驗工作中需要利用靈敏度較低的紫外檢測器做初步判別。本實驗建立的UPLC-DAD 法可滿足保健食品的初篩及定量要求，較質譜法更利于推廣。

4 結論

本研究根據實際檢測工作的需要以及前期實驗的積累，建立了一種快速篩查方法。涉及13種化學物質并具有一定的代表性。優化后的方法較原國標方法在時間上縮短至20 min，大大提高了檢測效率、降低了檢出限、提高了靈敏度、減少假陽性的風險；其次，出峰快體積流量小、節省流動相，更環保。該方法適用于保健食品中非法添加藥物的初步篩查及陽性藥物的定量檢測，已用于日常檢驗工作中，尤其在承接公安辦案類應急檢測中，縮短檢測時間，有力的提升了檢驗效率。