雷公藤甲素通過PD-1／PD-L1信號通路緩解腎移植急性排斥反應的作用

陳學勛，孫己晶，劉葉偉，孫秀菊，李香玲，張海波，郭 民?

（1.濰坊醫學院附屬醫院，山東 濰坊261041；2.濰坊醫學院，山東 濰坊261000；3.濰坊市峽山經濟生態開發區人民醫院，山東 濰坊261000）

慢性腎臟病已成為全球健康問題，腎移植是終末期腎臟病的最佳治療方法［1］。腎移植面臨的最主要難題排斥反應，研究證實，急性排斥反應主要是T 細胞介導的免疫應答，效應性活化T 細胞CD3＋、CD4＋等的增殖，調節性T 細胞的衰減所造成移植器官的損害［2］。雷公藤甲素（triptolide TPT）是從雷公藤中提取的抑制T 細胞增殖最強的有效成分，器官移植術中臨床和實驗都證明了雷公藤甲素能夠通過抑制T 細胞增殖，上調調節性T 細胞而有效地延長移植物存活時間并且能夠預防移植物抗宿主病的發生［3-4］，具體機制可能通過多條信號通路途徑實現抗排斥反應。程序性死亡配體（programmed death ligand 1，PD-L1）是屬于B7家族的一種抑制性共刺激分子，與程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）結合后，抑制活化T 細胞增殖，PD-1和PD-L1通過多途徑提供調節中樞和外周耐受的抑制信號，其中調節性T 細胞可能是其重要的靶點，從而對移植器官有保護作用［5-6］。本研究旨在闡明PD-1／PD-L1信號通路在雷公藤甲素緩解腎移植急性排斥反應中的作用及機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性Wistar 大鼠3個月齡，體質量（200±15）g，來源于濰坊醫學院動物實驗室，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號SCXK（魯）20140007。實驗動物中心飼養大鼠恒定的溫度（21±1）℃和濕度50%～70%。日／夜周期計算維持在12 h。所有程序均經濰坊醫學院附屬醫院動物倫理委員會批準通過。

1.2 試藥 雷公藤甲素（批號QZ000326，含有量≥98%）購于南京青澤醫藥技術發展有限公司；anti-mouse PD-L1（批號AM85436）購于美國BioXcell 公司；血清肌酐試劑盒（批號180681）購于瑞士Roche 公司；ECL 試劑（批號A4306）購于德國Amersham Biosciences 公司；兔抗人PDL1一抗（批號160509201764）、HRP 標記的IgG 二抗（批號1923102018132）購于美國CST 公司；RNA 提取試劑盒（批號4381662）、逆轉錄試劑盒（批號1600533）購于美國R＆D Systems 公司。

1.3 儀器 手術器械均購自上海醫療器械公司；手術顯微鏡購于鎮江光學儀器有限公司；流式細胞儀購于美國BD 公司；全自動生化分析儀購于美國Beckman Instruments 公司；聚氟乙烯薄膜（P4502）購于美國Pall Life Sciences 公司。

2 方法

2.1 腎移植模型 選擇健康雄性Wistar 大鼠8只作為空白對照，健康雄性SD 大鼠32只作為供體，另取32只健康雄性Wistar 大鼠作為受體。供體大鼠建模前12 h 禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定手術桌上，經中線切口顯露左腎，結扎腎上腺動靜脈分支，切斷腎動脈，4 ℃灌流含肝素生理鹽水經腹主動脈至腎動脈，然后分離輸尿管，將左腎靜脈連接導管后取出腎臟保存于4 ℃含肝素生理鹽水中。受體大鼠同樣步驟麻醉固定。受體腎暴露后移除，供腎通過導管連接，開放動脈靜脈后移植腎供血發紅，尿液從輸尿管流出2～3 min。大鼠術后不限飲食，均接受青霉素（104 IU／kg）肌肉注射7 d。

2.2 雷公藤甲素（triptolide，TPT）溶劑配制 雷公藤甲素20 mg／支，加入二甲基亞砜1 mL，50 ℃超聲震蕩30 min，加注射用水配成含雷公藤甲素0.1 mg／mL 的溶液，除菌過濾分裝，4 ℃冷藏保存備用。

2.3 分組 空白對照組8例不做任何處理；急性排斥（acute renal allograft rejection，AR）組，腹腔注射生理鹽水；雷公藤甲素組，腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg；anti-PDL1組，腹腔注射抗鼠程序性死亡配體1抗體（anti-mouse PD-L1）3 mg／d；雷公藤甲素＋anti-PD-L1組，同時腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg、anti-mouse PD-L1 3 mg／kg。從移植后當日開始腹腔注射給藥，1次／d，直到大鼠臨近死亡處死，每組8只。

2.4 生長狀態和腎功能評價 記錄存活時間（d）、體質量（g）和生理狀態，檢測血清肌酐水平。

2.5 腎組織形態學觀察 腎移植后5 d 各組處死3只獲得腎組織，其余腎組織待大鼠萎靡不振，呼吸微弱，臨近死亡狀態時處死獲取，甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，脫水，進行HE 和PAS 染色。按Banff 標準評價排斥反應程度，根據炎癥因子浸入程度，腎間質損害程度分為6級，正常、交界性改變、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲa 級、Ⅲb 級。

2.6 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 方法檢測。根據制造商的說明，用TRIZOL 提取和反轉錄成cDNA，提取總RNA。引物設計Primer 6.0和合成由Invitrogen 公司（表1）。進行反應，在55 ℃1 min，其次是35個周期的92 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃為35 s。GAPDH 作為內參照。按2-△△CT方法計算結果。

表1 引物序列

2.7 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。液氮研磨后與RIPA 處理15～30 min，超聲波處理4次，5 s／次，4 ℃10 000g／min 離心5 min，取上清液。總蛋白進行10% SDSPAGE 電泳分離和轉移到PVDF 膜，5%脫脂奶2 h 封閉后，膜在PD-L1單克隆抗體（稀釋1 ∶1 000）孵育，4 °C 過夜。清洗后的膜PBST，進一步加入二抗（稀釋1 ∶2 000）30 min，膜處理的ECL 為1 min，并在X 射線下曝光。Quantity One 軟件測定結合密度。所有實驗均重復4次。

2.8 T 細胞亞群檢測 移植后5 d 負壓方法收集腹主動脈血，室溫靜置30 min 后，在4 ℃下3 600 r／min 離心，上清液保存于-20 ℃，腎組織保存于-80 ℃。流式試管4支，加入100 uL 抗凝后的外周血，試管一中加入5 μL 的CD3-PC5抗體，試管二管中加入5 μL 的CD4-FITC 抗體，試管三管中加入5 μL 的CD8-PE 抗體，試管四中分別加入5 μL的CD4-FITC 抗體和CD25-PE 抗體，低溫靜置1 h，然后添加裂解紅細胞試液5 mL，然后置于離心機上，設置半徑為8 cm，1 000 r／min，共計5 min，去除澄清部分，PBS 洗滌2次，使用FACS-Calibur 流式細胞儀器進行檢測，使用PEMSS 4.0統計軟件對測量數據進行收集與分析。

2.9 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 生存狀態、腎功能 雷公藤甲素組大鼠具有良好的狀態，在腎移植的第15天開始出現排尿異常、萎靡不振和死亡；急性排斥組和雷公藤甲素＋anti-PD-L1組在第8天，Anti-PD-L1組在第5天就開始出現上述情況。與急性排斥組比較，雷公藤甲素組大鼠存活時間、體質量顯著升高（P＜0.05），anti-PD-L1組以上指標顯著降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組以上指標顯著高于anti-PD-L1組（P＜0.05）。與急性排斥組比較，雷公藤甲素組血肌酐水平顯著降低（P＜0.05），anti-PD-L1組顯著升高（P＜0.05），而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組顯著低于anti-PD-L1組（P＜0.05），見表2。

3.2 腎組織形態學觀察 急性排斥組典型急性排斥反應表現為彌漫的炎性細胞浸潤，間質細胞水腫變性，動脈彌漫炎癥，皮質出血等表現。anti-PD-L1組急性排斥反應最為嚴重；雷公藤甲素組病理表現較其他各組均減輕，有2例交界性病理改變；雷公藤甲素＋anti-PD-L1組急性排斥反應表現介于急性排斥組和雷公藤甲素組。見圖1、表3。

表2 生存狀態及腎功能情況（， n=8）

表2 生存狀態及腎功能情況（， n=8）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP ＜0.05；與雷公藤甲素＋anti-PD-L1組比較，dP＜0.05

圖1 腎臟病理急性排斥分級（HE×200）

表3 腎臟病理Banff 分級（只， n=8）

3.3 在腎臟組織中PD-L1mRNA 和蛋白表達 與急性排斥組比較，雷公藤甲素組、雷公藤甲素＋anti-PD-L1組腎組織（PD-L）1 mRNA 和蛋白表達明顯升高（P＜0.05），anti-PD-L1組表達降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 PD-L1蛋白在腎臟組織中的表達

3.4 T 細胞亞群及調節性T 細胞比率 與急性排斥組比較，雷公藤甲素組CD3＋T、CD4＋T 細胞比率、CD4＋／CD8＋明顯降低，CD8＋T、CD4＋CD25＋細胞比率明顯升高（P＜0.05），anti-PD-L1組CD3＋T、CD4＋T 細胞比率、CD4＋／CD8＋明顯升高，CD8＋T、CD4＋CD25＋細胞比率明顯降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組則能顯著逆轉Anti-PD-L1組T 細胞比率（P＜0.05）。見表5。

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在腎臟組織中的表達（，n=8）

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在腎臟組織中的表達（，n=8）

注：與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP＜0.05

表5 T 淋巴細胞亞群及調節性T 細胞比率（， n=8）

表5 T 淋巴細胞亞群及調節性T 細胞比率（， n=8）

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05；與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP ＜0.05；與雷公藤甲素＋anti-PD-L1組比較，dP＜0.05

4 討論

急性排斥反應早期階段T 淋巴細胞在腎移植排斥反應過程中占主導地位，CD3＋T 細胞、CD4＋T 細胞、CD8＋T 細胞是主要的效應細胞［2，7-9］。活化的效應性T 淋巴細胞的增殖和細胞因子產生，調節性T 細胞（Treg T）的數量和活性降低，均在移植腎急性排斥反應中起到關鍵性作用［10-11］。本實驗急性排斥組與對照組的大鼠腎臟病理及T淋巴細胞亞群等比較，病理上表現急性排斥，Banff 分級在Ⅰ-Ⅲb 級，炎性細胞浸潤，血肌酐顯著升高，效應性CD3＋致［2，8-9］。表明CD3＋T 細 胞、CD4＋T細胞、CD8＋T 細 胞、CD4＋CD25＋調節性T 細胞在急性排異反應及誘導和維持免疫T 細胞、CD4＋T 細胞、CD4＋／CD8＋顯著升高，CD8＋T 細胞、CD4＋CD25＋調節性T 細胞顯著下降，與以往國內外研究一耐受過程中起到關鍵性作用。

近年來的研究表明，程序性死亡配體（PD-L1）具有負性調節T 細胞和B 細胞依賴的免疫反應介導的T 細胞的活性［5，6，12-13］。許多實驗證 明PD-1／PD-L1相互作用 抑制CD4＋T 細胞、CD8＋T 細胞的增殖，誘導凋亡，同時使細胞因子下降從而減輕排斥反應［5，6，12-16］。前期實驗觀察到腺病毒介導的PD-L1局部轉染的方式應用于腎移植及其他器官移植，均可觀察到延長移植物的存活時間，減輕急性排斥反應的程度［5，12，14］。本實驗發現空白對照大鼠腎臟組織內未發現PD-L1的表達，只在活化的T 細胞表達，與以往學者研究相同［5，12-15］。建立大鼠急性排斥反應，給予antimouse PD-L1阻斷PD-1／PD-L1后，PD-L1表達下調，炎癥狀態失控，與各組比較，出現大鼠生存狀態最差，腎功能最糟糕，存活時間最短，急性排斥反應病理分級最嚴重，效應性T 細胞增殖明顯，調節性T 細胞比例明顯下降，與學者證實腎移植急性排斥反應腎小管損害負相關一致［15-17］。說明阻斷PD-1／PD-L1信號通路加重腎移植急性排斥反應，在其中起到重要作用。

雷公藤甲素是傳統中藥雷公藤的提取物，是雷公藤提取物中抑制已經活化的T 細胞最強的單體，而對處于靜止期的T 細胞作用并不顯著［3-4］。實驗證明，雷公藤甲素可通過多條途徑對于T 細胞的產生抑制作用，對多種T 淋巴細胞存在抑制作用，同時有提升對調節性T 細胞的作用［3-4，18-19］。本實驗結果表明，雷公藤甲素組大鼠腎臟組織中PD-L1表達顯著增加，抑制效應性T 細胞CD3＋T 細胞、CD4＋T 細胞、CD4＋／CD8＋，CD8＋T 細胞、CD4＋CD25＋調節性T 細胞顯著上升，從而使大鼠生存狀態最好，存活時間最長，腎功能狀態最佳，急性排斥反應分級最輕，證實雷公藤甲素可使PD-L1的表達增強和增加調節性T 細胞的比率，抑制效應性T 細胞活化，從而在抗排斥反應中起到良好效果。

PD-L1和CD4＋CD25＋調節性T 細胞在T 細胞的活化、增殖、凋亡方面有密切的聯系，研究證實PD-1和PD-L1在Treg 上均有高表達，對誘導調節性T 細胞的產生作用重大［20-21］。CD4＋CD25＋調節性T 細胞表達多種表面分子，主要包括抑制性共刺激分子CTLA-4、PD-1等抑制免疫反應并且誘導和維持免疫耐受［20-22］。曾有報道應用PD-L1單抗阻斷PD-1／PD-L1通路后抑制了CD4＋CD25＋調節性T 細胞的功能［20，23］。本實驗發現雷公藤甲素可增加PD-L1表達，增加調節性T 細胞，從而減輕腎移植的排斥反應，且另一組大鼠給予雷公藤甲素及anti-mouse PD-L1的腹腔灌注，阻斷了PD-1／PD-L1。不論是大鼠生存狀態，腎功能，存活時間，急性排斥反應病理分級，還是效應性T 細胞增殖，調節性T 細胞的比率等情況均差于雷公藤甲素組，卻好于anti-PD-L1組，說明阻斷PD-1／PD-L1通路降低了調節性T細胞比率，減弱了其效能，使雷公藤甲素的抗排斥效果顯著下降，推測CD4＋CD25＋調節性T 細胞是PD-1／PD-L1信號通路介導的雷公藤甲素抗腎移植急性排斥反應的重要靶點及機制。證明雷公藤甲素在緩解腎移植急性排異反應中PD-1／PD-L1信號通路是其發揮抗排斥反應的重要信號通路之一。

綜上所述，本研究證實，雷公藤甲素可上調PD-L1基因表達，增加調節性T 細胞的比率，抑制效應性T 細胞的增殖，抑制移植排斥反應，延長移植物的存活時間。PD1／PD-L1可能在雷公藤甲素抗排斥反應信號通路中發揮一定作用，CD4＋CD25＋調節性T 細胞可能是PD-1／PD-L1信號通路介導的雷公藤甲素抗腎移植急性排斥反應的重要靶點。