虎杖醇提物對阿爾茨海默病模型小鼠的影響

張二飛，殷 紫，齊 越，錢 俊，張朝晨

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院制藥工程學院，江蘇 淮安223003；2.江蘇護理職業(yè)學院檢驗藥學系，江蘇 淮安223001；3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院遼寧 沈陽110034；4.淮安市婦幼保健院藥劑科，江蘇淮安223001）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征為腦內(nèi)的不同腦區(qū)，特別是海馬區(qū)內(nèi)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的過量產(chǎn)生和聚集。Aβ 是淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）在β-和γ-分泌酶作用下衍生而成［1］，具有神經(jīng)毒性作用［2］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 與學習記憶密切相關(guān)［3］，大鼠海馬和腦室內(nèi)微量注射Aβ，可導致學習和記憶缺陷［4-5］，同時伴隨著腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達的減少。

虎杖為多年生草本植物虎杖Polygouum cuspidutumSieb.et Zucc 的干燥根莖和根，前期研究表明，虎杖醇提物具有改善AD 模型小鼠學習記憶能力，抑制tau 蛋白磷酸化的作用［5］，但對于是否具有降低Aβ 的作用尚不明確。因此本研究以Aβ25-35側(cè)腦室注射誘導AD 小鼠模型，觀察虎杖醇提物對Aβ 含有量的影響及其相關(guān)機制，旨在為藥物治療AD 提供更為優(yōu)選的藥物。

1 材料

1.1 動物 選取8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，SPF 級ICR小鼠78只，雄性，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）：2010-0001，動物購買后，飼養(yǎng)于遼寧省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，使用許可證號SYXK（遼）：2010-0003。

1.2 試藥 虎杖中藥飲片購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院的中藥局，經(jīng)藥學室姜鴻研究員鑒定為虎杖中藥材。虎杖醇提物提取過程如下，虎杖干燥的根，切成小段，取495 g，加入8倍量70%的乙醇，于90 ℃加熱回流提取2 h，過濾，藥渣再次加入6倍量70%的乙醇，90 ℃加熱回流提取2 h，共2次，3次濾液合并后，85 ℃減壓濃縮后，獲得浸膏91.47 g，每1 g 浸膏相當生藥5.41 g。鹽酸多奈哌齊片［衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司提供，批號131219A，規(guī)格5 mg／片］；Aβ25-35（美國Sigma 公司，貨號A4559）；小鼠Aβ1-40試劑盒（美國invitrogen 公司，貨號KMB3441），小鼠Aβ1-42試劑盒（美國invitrogen 公司，貨號KMB3481）；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）（英國Abcam 公司，貨號ab108319）；5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK，英國Abcam 公司，貨號ab32112）；磷酸化5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-AMPK，英國Abcam 公司，貨號ab133448）；過氧化物酶體增值物激活受體（PGC-1α，英國Abcam 公司，貨號ab54481）；酪氨酸激酶B（TRKB，北京博奧森科技有限公司，貨號bs-0288R）；磷酸化酪氨酸激酶B（p-TRKB，北京博奧森科技有限公司，貨號bs-5526R）；β-激動蛋白（β-actin，北京博奧森科技有限公司，貨號bs-0061R）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H ＋L，英國Abcam 公司，貨號ab6721）。

1.3 儀器 DW-200型腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）；Western blot 電泳儀（美國BIO-RAD 公司），Azure AO 型酶標儀（美國Azure 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 小鼠在實驗動物中心適應性飼養(yǎng)并觀察1周后，按體重隨機分為假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊（1.3 mg／kg）及虎杖醇提物低、中、高劑量組（2、6、18 g／kg生藥）分籠飼養(yǎng)，每組13只，自由進食，飲水。Aβ25-35在進行側(cè)腦室注射前，要將其老化，具體過程如下，將Aβ25-35溶解于無菌的生理鹽水中，置于37 °C 培養(yǎng)箱中，連續(xù)孵育120 h 后，取出，準備進行側(cè)腦室注射。各組小鼠腹腔注射350 mg／kg 水合氯醛，麻醉后，固定于腦立體定位儀上，剔除頭部毛發(fā)，碘酒、酒精消毒。沿顱骨中線用手術(shù)刀切開頭部皮膚，長度約2 cm，暴露囟門，以囟門為零點，旁開1.0 mm，向后0.5 mm，深度3.0 mm，在2 min內(nèi)將3 μL 老化的Aβ25-35緩慢注射入側(cè)腦室內(nèi)，留針5 min，緩慢將針拔出。手術(shù)后的小鼠放入鼠籠飼養(yǎng)（注意保暖）。假手術(shù)組小鼠注入等體積的生理鹽水。造模后第2天，各組小鼠按20 mL／kg 給藥容積灌胃給藥，1次／d，連續(xù)灌胃21 d。用0.5% 羧甲基纖維素鈉（0.5% CMC -Na）將虎杖醇提物溶解到相應的濃度，即2、6、18 g／kg 生藥，假手術(shù)組和模型組給予相應體積的0.5% CMC -Na。

2.2 檢測Morris 水迷宮行為學 各組小鼠于第16天給藥結(jié)束1 h 后進行Morris 水迷宮定位航行實驗。Morris 水迷宮的裝置為白色鐵質(zhì)圓桶，高33 cm，底面直徑為80 cm，頂部開口。將水迷宮底面分別標記Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限，平臺放置于Ⅰ象限處，低于水平面1 cm。保持圓桶內(nèi)水溫為25 ℃左右。實驗進行時，要記錄各組小鼠從入水處到可發(fā)現(xiàn)平臺并能成功登錄平臺的距離，即為總路程。若不能成功登陸平臺，要訓練能夠找到，并在平臺上保持10 s。每天每只小鼠訓練游泳2次，間隔時間為4 h，連續(xù)進行5 d。

2.3 ELISA 測定小鼠海馬內(nèi)可溶性及難溶性Aβ 水平21 d 給藥后1 h，每組取8只小鼠，冰上取出海馬組織，置于離心管中，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液，冰上勻漿10 s，間歇30 s 后，再次勻漿10 s，重復5次；4 ℃、20 000 r／min 離心5 min，收集上清，用作檢測可溶性待測物質(zhì)；在離心沉淀物中加入70% 甲酸，冰上勻漿；4 ℃，44 000 r／min 離心5 min，以1 mol／L Tris 中和上清，分裝，用作檢測非可溶性待測成分。按照ELISA 試劑盒說明書的操作步驟進行測定。

2.4 Western blot 測定小鼠海馬AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表達 21 d 給藥后1 h，每組取5只小鼠，斷頭處死后，分離海馬，稱定質(zhì)量。加入蛋白裂解液，提取總蛋白，BSA 法測定組織中的蛋白濃度。采用12%的凝膠進行電泳，100 mA，2 h 進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，加入相應濃度的一抗，于4 ℃處孵育靜置過夜。TBST洗滌3次，10 min／次，進行二抗孵育，TBST 再次洗滌3次，10 min／次，加入特超敏ECL 化學發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)觀察相關(guān)蛋白的表達。采用Image J 圖像分析軟件對WB條帶進行灰度分析，得到灰度值后，將模型組灰度值設(shè)定為1，其余各組按照對應的比率得到相應的灰度值，組間比較，進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計進行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 虎杖醇提物對阿爾茨海默病小鼠Morris 水迷宮的影響各組小鼠由于要在前3天摸索和適應水中環(huán)境，所以游泳總路程無明顯差異。隨著訓練天數(shù)的延長，第4天及第5天時，與假手術(shù)組相比較，模型組小鼠游泳總路程明顯延長（P＜0.05）；與模型組相比較，虎杖醇提物高、中劑量組以及鹽酸多奈哌齊組可明顯縮短游泳總路程（P＜0.05）。見圖1。

圖1 虎杖醇提物對阿爾茨海默病小鼠游泳總路程的影響

3.2 虎杖醇提物對阿爾茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組可溶性Aβ1-42、Aβ1-40與難溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，虎杖醇提物可顯著降低可溶性與難溶性Aβ1-42、Aβ1-40水平（P＜0.05）說明虎杖醇提物具有降低Aβ 水平的作用。見表1。

表1 虎杖醇提物對阿爾茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影響（pg／mg，， n=8）

表1 虎杖醇提物對阿爾茨海默病小鼠Aβ1-40、Aβ1-42水平的影響（pg／mg，， n=8）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05

3.3 虎杖醇提取物對阿爾茨海默病小鼠海馬AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表達影響 與假手術(shù)組比較，模型組p-AMPK、BDNF、p-TRKB 及PGC-1α 蛋白表達均減少（P＜0.05）；與模型組比較，虎杖醇提物高劑量組明顯增加p-AMPK、BDNF、p-TRKB 及PGC-1α 表達（P＜0.05）。見圖2、表2。

4 討論

圖2 虎杖醇提取物對阿爾茨海默病小鼠海馬AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表達影響

表2 虎杖醇提取物對阿爾茨海默病小鼠海馬AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表達影響（， n=5）

表2 虎杖醇提取物對阿爾茨海默病小鼠海馬AMPK、PGC-1α、BDNF、TRKB 蛋白表達影響（， n=5）

注：與假手術(shù)組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

阿爾茨海默病的主要病理特征包括tau 蛋白磷酸化、Aβ 沉積及神經(jīng)元丟失。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 產(chǎn)生增多或清除減少可導致Aβ 的異常聚集，進而導致神經(jīng)元損傷，加重阿爾茨海默病的認知功能障礙。最近的研究發(fā)現(xiàn)，采用PET對阿爾茨海默病患者腦部進行檢查，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者腦內(nèi)存在大量的Aβ 沉淀［6］。因此，抑制Aβ 的集聚可改善阿爾茨海默病的學習記憶功能。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，虎杖醇提物可減少可溶性及難溶性Aβ 的含有量，說明虎杖醇提物具有抑制Aβ 聚集的作用。

BDNF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，存在于海馬、皮質(zhì)，杏仁核和小腦中，含有量豐富，具有調(diào)控神經(jīng)細胞生長、分化及突觸可塑性的作用，并可能參與了阿爾茨海默病的病理過程［7］。BDNF 與海馬的學習和記憶過程有關(guān)，具有學習記憶障礙的阿爾茨海默病患者及阿爾茨海默病模型小鼠BDNF 水平降低。Aβ 可通過干擾其軸突運輸影響突觸處的BDNF 水平［8］。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF 通過與高親和力受體酪氨酸激酶（TrkB）結(jié)合后，促使酪氨酸激酶發(fā)生磷酸化，活化后的受體觸發(fā)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，進一步提高了突觸聯(lián)系，從而增強其學習記憶能力。本研究結(jié)果表明，虎杖醇提物可增加阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)的磷酸化酪氨酸激酶水平，提高BDNF 的表達。

PGC-1α 為調(diào)節(jié)線粒體功能的關(guān)鍵因子，在腦內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。PGC-1α 的缺乏，可導致神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)異常和丟失，抗氧化防御系統(tǒng)損傷等［9］。阿爾茨海默病患者腦內(nèi)PGC-1α 水平明顯降低。最近的研究顯示，PGC-1α 表達的增加，可改善阿爾茨海默病患者的認知功能障礙［10］。本研究結(jié)果表明，虎杖醇提物可增加PGC-1α 的表達。此外，Aβ 可通過PGC-1α 途徑抑制BDNF 的表達。由此進一步說明，虎杖醇提物可能是通過增加PGC-1α 表達，提高磷酸化酪氨酸激酶和BDNF 水平，進而抑制Aβ 聚集。

AMP 激活蛋白激酶（AMPK）作為調(diào)節(jié)PGC-1α 的代謝反應元素之一，在減少Aβ 生成中起著重要的作用［9］。AMPK 的活性主要受細胞內(nèi)的AMP／ATP 比值進行調(diào)節(jié)。生理狀況下，細胞內(nèi)保持著高濃度的ATP 水平，用以維持基本的細胞代謝需求，此時，AMPK 主要以無活性的狀態(tài)存在，AMP／ATP 比值降低［10］。阿爾茨海默病腦內(nèi)AMPK活性下降時，伴隨著PGC-1α 及BDNF 表達下調(diào)［11-12］。激活AMPK 可改善阿爾茨海默病腦內(nèi)的能量代謝紊亂［13］，增加PGC-1α 及BDNF 表達，抑制Aβ 的生成。本研究結(jié)果表明，虎杖醇提物可提高p-AMPK／AMPK 比率，促使BDNF及PGC-1α 表達增加。

綜上所述，虎杖醇提物改善阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶能力，可能是通過增加AMPK 的活性，改善了腦內(nèi)的能量代謝紊亂，促使PGC-1α 及BDNF 表達增加，從而降低了腦內(nèi)Aβ 的集聚。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ 還可促使tau 蛋白異常磷酸化［14-15］。結(jié)合前期研究，虎杖醇提物具有抑制tau 蛋白異常磷酸化的作用，可推測，虎杖醇提物可能是通過AMPK／PGC-1α／BDNF／TRKB 信號通路，降低Aβ 的產(chǎn)生，進而抑制tau 蛋白的過度磷酸化，從而改善了阿爾茨海默病模型小鼠的學習記憶障礙。

雖然實驗已經(jīng)證明虎杖醇提物可通過調(diào)控AMPK 活性增加，促使PGC-1α 及BDNF 表達上調(diào)，改善學習記憶功能，但影響PGC-1α 表達的其他因素，如c-AMP 反應元件結(jié)合蛋白（CREB）及酵母沉默信息調(diào)節(jié)子（SIRT），仍有必要在未來的實驗中進行進一步的研究，以便更為詳實的探討虎杖醇提物抗阿爾茨海默病的作用機制。