次旦多吉，巴桑卓嘎，達娃卓瑪

（西藏自治區食品藥品檢驗研究院，西藏自治區藏藥標準化研究重點實驗室，西藏 拉薩850000）

十三味菥蓂丸是藏族驗方，最初由藏醫藥學者嗒布拉吉研制，其配方和功能主治記載于公元十九世紀著名藏醫藥學家貢追·云旦加措編著的《臨床札記》 中，并沿用至今，收載于1995年版《衛生部藏藥標準》 第一冊、國家藥品監督管理局標準［WS-625（Z-170）-2002試行］［1］。方中菥蓂子、芒果核、蒲桃、大托葉云實清熱補腎，干簧水，可治療膀胱炎癥、腎熱［2-5］；紫草茸、茜草、山礬葉、圓柏枝清熱消炎，可治療腎炎擴散熱癥、腰肌酸痛、療毒癥［6-8］；豆蔻、刀豆溫腎壯陽，可治療寒、熱性腎虛［9-10］；訶子、波棱瓜子、巴夏嘎清血，可治療膽熱癥［11-14］，全方功效清熱解毒、消炎止痛、通淋，可用于膀胱炎癥、淋病、腎擴散熱癥及浮腫、水腫、寒熱引起的陰囊腫脹等疾病。

目前，十三味菥蓂丸在全國共有9個批準文號，但其現行檢驗標準只有性狀、重量差異、水分，以及茜草、紫草茸主要成分的TLC 定性鑒別，缺乏組方藥材質控指標及定量標準，難以全面保證產品質量穩定性和用藥安全性，而且該標準已經數十年未作修改。另外，對中藥品種的研究大多從含有量控制角度出發，較少考慮到藥品常規顯微鑒別和薄層鑒別［15-18］。

本實驗從菥蓂子、茜草、豆蔻、山礬葉、紫草茸顯微鑒別，茜草、菥蓂子、刺柏TLC 定性鑒別，以及成分、重金屬含有量測定等方面出發，對十三味菥蓂丸展開了較系統的研究，以期能為該制劑質量標準的提升提供參考，也可更好地推動其質量評價與監管工作。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器）、Agilent 7700ICP-MS 儀（美國Agilent 公司）；XP205、XP504電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MDS-2002A 微波消解儀（北京合悅達科技有限公司）；SBX51顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥 茜草（編號XZBBG-1-9）、刺柏（編號XZBBG-2-11）對照藥材，來自西藏自治區食品藥品檢驗研究標本室；菥蓂子（批號121599-201202）對照藥材，購自中國食品藥品檢定研究院。黑芥子苷對照品（批號X1450010），購自上海安譜實驗科技股份有限公司，含有量高于98.5%。十三味菥蓂丸由5家生產企業提供，A 廠家提供 13個批號（CY20160136、CY20160137、CY20160138、CY20160183、CY20160184、CY20160185、CY20160209、CY20160218、CY20160261、CY20160293、CY20160309、CY20160315、CY20160310，編號1～13），B廠家提供 8個批號（CY20160150、CY20160186、CY20160187、CY20160212、CY20160213、CY20160262、CY20160314、CY20160322，編號14～21），C 廠家提供3個批號（CY20160199、CY20160303、CY20160316，編號22～24），D 廠家提供1個批號（CY20160143，編號25），E 廠家提供1個批號（CY20160307，編號26）。鉛［編號-批號GBW（E）080129-15101，標準值100 μg／mL］、鎘（編號-批號GBW08612-15062，標準值1 000 μg／mL）、砷［編號-批號GBW（E）080117-15102，標準值100 μg／mL］、汞（編號-批號GBW08617-15096，標準值1 000 μg／mL）、銅（編號-批號GBW08615-15111，標準值1 000 μg／mL），均購自中國計量科學研究院。乙腈為色譜純（美國Fisher Scientific 公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（美國Millipore 公司）。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 本品粉末呈紅棕色，種皮細胞為棕色薄壁細胞，表面觀類多角形，單個散在類圓形（菥蓂子）；胚乳細胞呈多角形，充滿細小的淀粉粒，集成團，包埋細小偶見的草酸鈣方晶、深淺不一紅棕色色素、石細胞類圓形或多角形（豆蔻）；草酸鈣針晶束20～70 μm；偏光下呈紅白間多色彩（茜草）、草酸鈣簇晶單個或多個（山礬葉）；偶見腺毛長30～75 μm（紫草茸）。見圖1。

圖1 十三味菥蓂丸顯微特征

表1顯示，菥蓂子、豆蔻、茜草、山礬葉、紫草茸顯微特征在5家生產企業樣品中均能見到，表明其準確可靠，重復性好。

表1 5家生產企業樣品顯微鑒別結果

2.2 TLC 定性鑒別

2.2.1 茜草 取本品6 g，研細，加30 mL 甲醇超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加20 mL 水溶解，再加1 mL稀鹽酸，等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸干，1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；取對照藥材0.5 g，同法制成相應溶液。按照2015年版《中國藥典》 四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-丙酮-甲酸（5 ∶5 ∶0.8 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖2。由圖可知，樣品色譜在對照藥材相應位置上顯相同顏色熒光斑點，分離度較好，陰性無干擾。

圖2 茜草TLC 色譜圖

2.2.2 菥蓂子 取本品4 g，研細，加20 mL 石油醚（30～60 ℃），過濾，殘渣加70%乙醇加熱回流30 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液；取對照藥材0.5 g，同法制成相應溶液。按照2015年版《中國藥典》四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各3～5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水-乙酸（8 ∶1 ∶1 ∶1 ∶0.2）為展開劑，展開（展距12 cm），取出，晾干，噴以3%氯化鋁乙醇溶液，105 ℃下加熱后置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖3。由圖可知，樣品色譜在對照藥材相應位置上顯相同顏色熒光斑點，分離度較好，陰性無干擾。

圖3 菥蓂子TLC 色譜圖

2.2.3 刺柏 取本品4 g，研細，加70%甲醇25 mL、鹽酸1 mL，加熱水解1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 溶解，乙酸乙酯提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液；另取對照藥材1 g，同法制成相應溶液。按照2015年版《中國藥典》四部薄層色譜法0502，吸取上述2種溶液各5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以（環己烷-三氯甲烷）-乙酸乙酯-冰醋酸（20 ∶5 ∶8 ∶0.1）為展開劑，展開（展距14 cm），取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，置于紫外燈（365 nm）下檢視，結果見圖4。由圖可知，樣品色譜在對照藥材相應位置上顯相同顏色熒光斑點，分離度較好，陰性無干擾。

圖4 刺柏TLC 色譜圖

2.3 黑芥子苷含有量測定

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對照品溶液 精密稱取黑芥子苷對照品適量，加水溶解，制成每1 mL 含0.12 mg 該成分的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液 取裝量差異項下的樣品，研細，精密稱取粉末約4 g，置于具塞錐形瓶中、精密加入40%乙醇50 mL，稱定質量，回流提取45 min，放冷，40%乙醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.1.3 陰性樣品溶液 按照處方比例制備缺菥蓂子的陰性樣品，按“2.3.1.2”項下方法制備，即得。

2.3.2 色譜條件及專屬性考察 Waters XSELECT CSH C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫30 ℃；流動相乙腈-0.02 mol／L 四丁基硫酸氫銨（氨試液調pH=6）（15 ∶85）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長227 nm；進樣量10 μL，色譜圖見圖5。由圖可知，陰性樣品在對照品色譜峰相應位置上無干擾峰出現，表明該方法專屬性良好。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液（0.668 5 mg／mL）2、4、8、12、20、30 μL，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y=19 200X＋415（r=0.999 7），在1.34～20.05 μg 范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 取同一對照品溶液10 μL，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得黑芥子苷峰面積RSD 為0.3%，表明儀器精密度良好。

圖5 黑芥子苷HPLC 色譜圖

2.3.5 重復性試驗 精密稱取樣品（5號）6份，按“2.3.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，測得黑芥子苷含有量RSD 為1.40%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 取同一供試品（5號）溶液10 μL，室溫下于0、2、4、8、10、12 h 在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，測得黑芥子苷峰面積RSD 為1.4%，表明溶液在12 h 內穩定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取樣品（5號）6份，加入等量對照品，按“2.3.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.3.8 樣品含有量測定 取5家生產企業26批樣品，按“2.3.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表3。

表2 黑芥子苷加樣回收率試驗結果（n=6）

表3 黑芥子苷含有量測定結果

2.4 重金屬含有量測定

2.4.1 供試品溶液制備 精密稱取樣品細粉0.25 g，置于聚四氟乙烯消解罐內，加硝酸5 mL 混勻，置于微波消解爐中，按操作規程安裝完裝置后按以下程序進行消解。

第1步：1 600 W 功率在3 min 內從室溫加熱至110 ℃，保持2 min。

第2步：1 600 W 功率在2 min 內從110 ℃加熱至150 ℃，保持3 min。

第3步：1 600 W 功率在3 min 內從150 ℃加熱至185 ℃，保持9 min。

消解結束后，冷卻至罐內溫度低于70 ℃，緩緩放氣，取出內罐置于加熱板上，110 ℃下加熱以使NO2蒸氣揮盡，并持續濃縮至2～3 mL，放冷，加水稀釋至50 mL，搖勻，即得。同法制備試樣空白溶液。

2.4.2 標準液制備 精密量取Pb、Cd、As、Hg、Cu 標準貯備液適量，2%硝酸制成每1 mL 分別含Pb 2、4、8、10、16、20 ng，Cd 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，As 2、4、8、10、16、20 ng，Hg 0.2、0.5、1、2、4、5 ng，Cu 25、50、100、150、200、250 ng，即得。

2.4.3 樣品含有量測定 按2015年版《中國藥典》 四部鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（2321）測定，結果見表4。

3 討論

3.1 顯微鑒別 結合十三味菥蓂丸工藝流程，個別藥味經過提取加工后無法鑒別顯微特征，在顯微鏡下只有淀粉粒、導管特征。本實驗發現，菥蓂子、豆蔻、茜草、山礬葉、紫草茸顯微特征在各生產企業樣品中均能見到，表明可將其作為該制劑顯微特征。

表4 重金屬含有量測定結果

3.2 TLC 定性鑒別 課題組前期對5家生產企業進行實地考察后發現，有些廠家對原藥材入庫檢驗不夠完善，而且依據標準沒有統一規范，許多原藥材辨認僅靠主觀經驗。菥蓂子、刺柏是十三味菥蓂丸中特色藥味，而且前者有效成分黑芥子苷含有量較高，是主要藥效成分，故本實驗對兩者進行TLC 定性鑒別。結果顯示，各生產企業樣品TLC色譜圖分離度良好，斑點顏色清晰，陰性無干擾。

3.3 成分含有量限度 26批樣品中黑芥子苷含有量范圍在1.12～7.5 mg／g 之間，表明差異較大，結合十三味菥蓂丸工藝流程及相關研究數據，目標成分按照轉移率80%計算，同時考慮到制劑存放時間、生產工藝穩定對黑芥子苷含有量的影響，暫訂本品每1 g 含菥蓂子以黑芥子苷計應為4.5～7.5 mg／g，由此可知有8批不符合規定，占30.8%，其原因可能與原料藥質量或生產工藝不穩定有關。另外，同一生產企業不同批次樣品，以及不同生產企業樣品中黑芥子苷含有量RSD 均在4% 以上，也印證了上述現象。

3.4 重金屬含有量限度 雖然十三味菥蓂丸不含重金屬，但本實驗發現As、Hg、Cu 超出規定值，而且差異較大，無明顯規律差異，可能是原材料引入的污染，也有可能是生產過程中的污染，難以作出統一的限量規定。WHO 規定，重金屬暫定每周耐受攝入量分別為Pb 0.025 mg／kg、Cd 0.007 mg／kg、As 0.015 mg／kg、Hg 0.001 6 mg／kg，即最大日攝入量（暫定每周耐受攝入量×60／7×1 000）分別為Pb 214 μg、Cd 60 μg、As 128 μg、Hg 14 μg，而本實驗測定結果（表4）遠低于該規定，即服用十三味菥蓂丸不會造成重金屬高攝入。

4 結論

十三味菥蓂丸為藏族驗方，方中用藥遵循藏醫藥傳統，但課題組前期調查發現部分生產企業用的藥材有茜草、巴夏嘎（塞北紫堇）、婆婆納、鴨嘴花，比較混亂，故應考以規范，明確藥材來源，建立統一標準。同時，該制劑原標準檢測項目過于簡單，設置不完善，無法真實客觀評價其質量狀況，更無法有效進行質量控制；本實驗從藥品質量標準方面對其顯微特征、TLC 定性鑒別、指標成分（黑芥子苷）及重金屬含有量測定進行較為系統的研究，以期為相關質量標準提高和修訂提供參考依據。