附子多糖純化工藝的優化及其毒性

丁興杰 蒲忠慧 熊 亮郭 力劉 菲?彭 成?

（1.成都中醫藥大學藥學院，教育部中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都611137；2.西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川 成都611137）

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，其味辛、甘，性大熱，有毒，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效。附子多糖是附子有效成分之一，具有調節免疫、抗腫瘤、保護心肌細胞、降血脂等作用［1］，近年來越來越受到重視［2-4］，目前相關工藝研究主要集中在提取上［5-7］，鮮有純化方面的報道。

透析法作為多糖經典的除小分子化合物方法，能有效提高附子多糖純度，而且損失較少。本實驗首次采用Box-Behnken 響應面法優化附子多糖純化工藝，并進行毒性研究，以期為該成分開發利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥 生附片（產地四川江油）購自四川江油中壩附子科技發展有限公司，經成都中醫藥大學藥學院高繼海副教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品。無水葡萄糖對照品（批號110833-200302，中國食品藥品檢定研究院）。中性蛋白酶（批號16110902，南寧龐博生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（如吉生物科技有限公司）。95%乙醇、蒽酮、硫酸均為分析純（成都科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器 Lambda 35型紫外-可見分光光度計；LDZ5-2型離心機；DSY-1-6型電熱恒溫水浴器；電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius 公司）；DB-211SC 型電熱鼓風恒溫干燥箱；MD34型透析袋（8 000～14 000 Da，美國Viskase 公司）；24孔板；移液槍。

2 方法

2.1 標準溶液配制

2.1.1 葡萄糖 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）。

2.1.2 蛋白質 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的牛血清白蛋白對照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）

2.1.3 二硝基水楊酸（DNS）精密稱取DNS 0.65 g，適量蒸餾水溶解后轉移至100 mL 棕色量瓶中，依次加入NaOH 溶液（2 mol／L）32.5 mL、丙三醇4.5 g，定容，搖勻，放置7 d，即得。

2.1.4 考馬斯亮藍 精密稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，依次加入95%乙醇50 mL、85%磷酸100 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，即得，置于棕色瓶中備用。

2.2 總糖標準曲線繪制 采用苯酚-硫酸法。精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖標準溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1.5 mL，再加入5%苯酚2 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.5 mL，室溫下顯色25 min；另取蒸餾水2 mL，同法顯色，作為空白對照，于最大吸收波長488 nm 處測定吸光度。以總糖質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程A=63.75X＋0.018（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.3 還原糖標準曲線繪制 采用DNS 法。精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖標準溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于比色管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.3”項下DNS 試劑2 mL，搖勻，沸水浴3 min，加純水17 mL，于最大吸收波長495 nm 處測定吸光度。以還原糖質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程A=21.72X-0.046（r=0.999 9），在0.015～0.035 mg／mL 范圍內線性關系良好。

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2.4 蛋白質標準曲線繪制 采用考馬斯亮藍法。精密吸取“2.1.2”項下蛋白質標準溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.4”項下考馬斯亮藍溶液5 mL，顯色15 min，于最大吸收波長590 nm 處測定吸光度，以蛋白質質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程A=52.6X＋0.092（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.5 純化工藝 采用單因素試驗，確定提取工藝為5 g 藥材粗粉加40倍量水煎煮4 h，過濾，濾液離心，上清液加80%乙醇醇沉，低溫放置過夜，離心，沉淀用水復溶，Sevage 法除蛋白后用透析膜透析。然后，通過苯酚硫酸法、DNS 法［8］測定多糖含有量。

2.5.1 醇沉體積分數對多糖損失率的影響 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至50%、60%、70%、80%、90%，靜置過夜，離心，加水復溶，測定多糖含有量，結果見圖1。由圖可知，醇沉體積分數80%時多糖損失率最低。

圖1 醇沉體積分數對多糖損失率的影響

2.5.2 除蛋白方法對多糖含有量的影響 蛋白質是粗多糖中最主要的雜質，其存在增加了多糖吸濕性，而且所帶電荷可吸附大量其他雜質和多糖，導致難以去除或分離［9］。取適量多糖溶于水，離心去沉淀，上清液分別用Sevage 試劑、三氟乙酸、中性蛋白酶除蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白質含有量，結果見圖2。由圖可知，雖然三氟乙酸法可將蛋白質除盡，但也會使多糖大量降解；酶法雖也可除盡蛋白質，但多糖含有量也較低，綜合考慮，選擇Sevage 法去除蛋白質。

圖2 除蛋白方法對多糖含有量的影響

2.6 透析工藝 通過MD34透析袋（8 000～14 000 Da）對多糖進行透析后，對透析時間、透析溫度、換液次數進行單因素考察［10］。

2.6.1 透析時間 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，更換緩沖液4次，透析溫度20 ℃，考察透析15、20、25、30、35 h 對多糖純度的影響，結果見圖3。由圖可知，透析30 h時多糖純度最高。

圖3 透析時間對多糖純度的影響

圖4 透析溫度對多糖純度的影響

2.6.3 換液次數 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，透析時間30 h，透析溫度40 ℃，考查換液3、4、5、6、7次對多糖純度的影響，結果見圖5。由圖可知，隨著換液次數增加，多糖純度逐漸提高，在6次時最高，但在7次時反而稍有降低，可能是由于換液頻繁會使小分子聚合糖流失。

圖5 換液次數對多糖的影響

2.6.4 工藝優化 在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，選擇透析溫度（A）、透析時間（B）、換液次數（C）作為影響因素，多糖純度（Y）作為評價指標，進行3因素3水平響應面分析，結果見表1。

表1 試驗設計及結果

然后，應用Design Expert 8.0.6.1軟件對表1數據進行多元回歸擬合，得方程Y=-270.689 00 ＋3.451 45A＋6.200 10B＋64.378 00C-0.029 300AB＋0.024 500AC＋0.100 00BC-0.035 390A2-0.093 360B2-5.439 00C2，方差分析見表2。由表可知，模型具有顯著性（P＜0.05），而失擬項不顯著（P＞0.05）；各因素影響程度依次為換液次數＞透析溫度＞透析時間；回歸方程擬合度和可信度均較高（R2=0.901 5，=0.884 6），預測性良好。

表2 方差分析

2.7 響應面分析 通過Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應面，見圖6。由圖可知，最優工藝為透析溫度36 ℃，透析時間31 h，換液次數6次，多糖純度為92.17%。

圖6 各因素響應面圖

2.8 驗證試驗 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至80%靜置過夜，離心，加水復溶，Sevage 法除蛋白，在透析溫度36 ℃、透析時間31 h、換液次數6次條件下進行多糖透析，冷凍干燥，得無色透明膠狀多糖，稱定質量，重復3次。結果，多糖提取率分別為9.64%、9.92%、9.58%，平均9.71%（RSD=1.85%）；純度分別為90.26%、92.71%、92.70%，平均91.89%（RSD=1.54%），與理論值92.17% 相當，表明工藝優化效果理想。

2.9 多糖毒性研究

2.9.1 心臟毒性 斑馬魚按雌雄比2 ∶1或1 ∶1的比例放入配魚缸中，次日早上利用光照刺激使其交配，待其產卵0.5～1 h 后，收集受精卵于胚胎培養液中，置于28.5 ℃孵箱中孵育48 h，其間每天更換胚胎培養液并棄除死卵，隨機分組放入24孔板中，每孔10只，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，斑馬魚繼續放入28.5 ℃孵箱中孵育。每12 h 觀察1次，記錄0.5 min內心跳次數，同時觀察胚胎心包及心臟形態，重復3次，每次用同一批胚胎，結果見圖7。由圖可知，不同質量濃度多糖對斑馬魚心率均無明顯影響（P＞0.05）。

圖7 多糖對斑馬魚心率的影響

2.9.2 胚胎毒性 選擇受精后10 h 發育正常的斑馬魚胚胎，隨機分組放入24孔板中，每孔10枚胚胎，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，胚胎繼續放入28.5 ℃孵箱中孵育，每12 h 觀察1次，記錄胚胎死亡率，重復3次，每次用同一批胚胎，結果見圖8。由圖可知，不同質量濃度多糖對斑馬魚胚胎死亡率均無明顯影響（P＞0.05）。

圖8 多糖對斑馬魚胚胎死亡率的影響

3 討論

傳統多糖含有量測定方法大多為苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法［11-12］，這是因為多糖醇沉后還原糖含有量可忽略不計，但在除蛋白過程中，各種試劑會造成多糖降解而產生還原糖，三氟乙酸法、中性蛋白酶除蛋白均是如此。由于多糖透析的目的是除去小分子還原糖，故本實驗采用苯酚-硫酸法、DNS 法測定多糖含有量。

Box-Behnken 響應面法是近年來發展起來的一種新的多變量統計分析技術［13］，可應用于多變量統計學分析，能對幾個因素的相互影響作出全面統計學分析，通過對擬合后的回歸方程進行分析，以尋找最優工藝參數，而且，它可更好地處理離散水平值，具有試驗數相對較少、精密度高等優點，能對各因素之間的交互作用進行研究［14］。本實驗采用Box-Behnken 響應面法優化附子多糖純化工藝，不僅使多糖透析時間降低到31 h，比傳統工藝下的72 h 縮短一半以上，還將其純度提升到91.89%，更適合工業化生產。

附子具有回陽救逆、補火助陽的功效，但有大毒。本實驗考察了附子多糖毒性，發現該成分無明顯心臟、胚胎毒性，安全性高，可為其開發利用提供參考。