ICP-MS 半定量和全定量聯合篩查小兒咳喘靈顆粒中元素

陳 榮，張華鋒

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州215104）

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃、金銀花、板藍根、苦杏仁、石膏、甘草、瓜蔞7味藥材，經分步水提、醇沉、濃縮、制粒而成。主要用于治療上呼吸道感染、咳嗽、氣管炎等，臨床應用廣泛［1］。作為一種常見兒科用藥，其原藥材種植、炮制、制劑生產加工、貯藏等過程中的重金屬及毒性元素污染問題更應引起重視。

電感耦合等離子體質譜因其樣品需求量少、動態范圍極寬（＞10個數量級）、極低的檢出限（達ng／kg 級）、適用多種元素分析、可進行同位素鑒別及測定、干擾較少且易于消除等優點，在醫藥、地質、環境等領域有非常重要的作用［2］。半定量分析是根據各元素的響應因子，對未知樣品中所有元素進行粗定量。對于全定量來說，半定量這一手段可以幫助更有針對性地檢測元素、估算標準樣品濃度范圍、優化內標選擇。目前針對中藥材、中成藥的元素全定量分析已成為常規檢驗手段，半定量分析在食品、環境等領域的應急監測中應用也時有報道［3-4］，左甜甜等［5］應用半定量方法篩查了13種中藥材的重金屬及有害元素，但將半定量分析與全定量結合應用在中藥制劑方面的報道較少。本實驗以小兒咳喘靈為例，經微波消解后，采用ICPMS 半定量方法進行全元素的掃描和濃度預估，再利用全定量方法對部分含有量較高或重金屬、有害元素進行定量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 7900電感耦合等離子體色譜（美國Agilent 公司）；CEM MARS6微波消解儀（美國培安公司）；Mettler Toledo XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Millipore Synergy 超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試藥 混合對照品溶液（含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn 各10μg／mL，批號3-148MKBY2）、內標溶液（含 Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb 各100 μg／mL，批號3-189MKBY2）和調諧液（含Ce、Co、Li、Mg、TI、Y 各 1μg／L，批 號 24-19GST2）均購于美國Agilent 公司，Hg 單元素對照品溶液（1000μg／mL，批號174026-3）購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。硝酸為UP 級（蘇州晶瑞化學股份有限公司），水由Millipore Synergy 超純水機制得。小兒咳喘靈顆粒為收集市售樣品，涉及12個廠家，26批次。具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1.1 內標、參比溶液 精密量取質量濃度為100 μg／mL 的內標溶液適量，加入2%硝酸配制成質量濃度分別為1、100 ng／mL 的混合溶液，其中1 μg／mL溶液作為內標溶液，100 ng／mL 溶液作為半定量測定的參比溶液。

2.1.2 對照品溶液 精密量取混合對照品溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成每1 mL 含各元素均為0、1、5、10、50、500 ng 的系列質量濃度混合對照品溶液。同時用2%硝酸溶液將汞單元素對照品溶液，稀釋成每1 mL 含汞0、0.5、1、1.5、2 ng的系列對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 取供試品0.4 g，精密稱定，加入硝酸8 mL，90 ℃預消解30 min，放冷，密塞，微波消解（消解程序為1 400 W，120 ℃，爬坡5 min，保持10 min；185 ℃，爬坡10 min，保持25 min，放冷，取出，用超純水轉移至50 mL 量瓶中，并沖洗3次，定容，作為供試品溶液。同法制備空白對照品溶液。

2.2 半定量分析

2.2.1 半定量分析儀器參數 氦反應模式；采集方式為質譜圖；峰型取6個點；積分時間0.1 s；重復次數1；掃描次數100；半定量分析；樣品提升速度0.3 r／s，提升時間20 s，穩定時間20 s；等離子體流量15 L／min；射頻功率1 550 W；載氣流量1.09 L／min。

2.2.2 半定量測定方法 檢測包括m／z為7至238的所有質量數，依次采集儀器背景噪音（超純水）、參比溶液、空白對照溶液、8批樣品溶液（編號1～8）數據，以參比溶液元素響應值及濃度值，計算并更新半定量響應因子，用于8批樣品的元素種類篩查及濃度測定。

2.2.3 半定量分析結果 8批樣品經半定量分析，顯示元素Li～U 中的75種元素的每秒計數（CPS值）及濃度值，通過與背景噪音、空白對照的CPS值、濃度值比較，計算各同位素間CPS 比值是否與其豐度比值對應等方式判定各個元素是否存在或有無定量必要。另外排除內標元素、部分非金屬元素（N、P、S、O、Si 等），以及考慮到重金屬元素及有害元素（Pb、Cd、As、Hg、Cu）篩查的必要，綜上考慮，選擇混合對照品溶液中Ag、Al、As、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Sr、V、Zn 以及單元素Hg進行定量測定。部分元素半定量結果見表2。

2.3 全定量分析

實驗材料有芹菜、蘆蒿、無機堿,實驗儀器有電動攪拌機(7312-I型,上海標本模型廠制造)、恒溫水浴鍋(HH-S,)、旋轉粘度計(NDJ-1型，上海昌吉地質儀器有限公司)、電子分析天平(AB204-N型，梅特勒-托利多儀器有限公司).

2.3.1 全定量分析儀器參數 氦反應模式；峰型取3個點；重復次數3；掃描次數100；全定量分析；一般元素積分時間設置為0.3 s，靈敏度度、難電離元素延長積分時間（Hg 為2 s，As、Cd 為1 s），采用虛擬內標進行內標修正，其余參數與半定量分析一致。

2.3.2 全定量分析方法 根據半定量分析中各元素濃度范圍，結合對照品溶液線性范圍，將供試品溶液用于Ag、Al、As、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Mn、Ni、Pb、Rb、Sr、V、Zn 及Hg的測定，另將供試品溶液再稀釋50倍用于Na、Mg、K 的測定。依次采集系列濃度混合對照品溶液、空白對照溶液、26批樣品溶液（編號1～26）、50倍稀釋后的26批供試品溶液、系列濃度汞元素對照品溶液數據，同時引入內標監測儀器狀態。

表2 部分元素半定量測定結果（mg／kg）Tab.2 Semi-quantitative results of several elements（mg／kg）

2.3.3 方法學

2.3.3.1 線性關系和檢出限 以對照品溶液質量濃度為橫坐標（X）、CPS 值為縱坐標（Y），進行回歸，各元素線性關系良好。連續采集樣品空白溶液11次，以其CPS 值標準偏差的3倍所對應的質量濃度作為檢出限，結果見表3。

表3 22種元素線性關系及檢出限Tab.3 Linear relationships and detection limit of twenty-two elements

2.3.3.2 精密度試驗 將10 ng／mL 混合對照品溶液以及含汞為1 ng／mL 對照品溶液，分別連續進樣5次，計算出22種元素RSD，除K、Al、Ca、Hg分別為6.7%、6.1%、5.4%、5.7%外，其他元素為0.2%～2.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.3 重復性試驗 取編號1（批號1707033）的供試品，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定除Na、Mg、K 外的其他元素，各元素RSD 為0.4%～5.1%。將上述供試品溶液，分別稀釋50倍，用于測定Na、Mg、K，3種元素RSD 分別為1.6%、0.8%、1.1%，表明該方法重復性良好。

2.3.3.4 加樣回收率試驗 將已知各元素含有量的編號1供試品取6份，精密加入10 μg／mL 混合對照品溶 液200 μL，1 μg／mL 汞對照品 溶液25 μL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，計算22種元素平均回收率，各元素加樣回收率為90.5%～115.1%。

2.3.4 全定量分析結果 22種元素全定量測定結果見表4～5，以全定量結果為真值，編號1～8號樣品中除Ca、Fe、Ga、Na、Mg、K 元素外，其他元素半定量測得值的相對偏差均小于±20%，且2種測量模式下的濃度范圍基本一致。參照國際人用藥物注冊技術協調會議（ICH）Q3D 元素雜質指南，將測定元素分為1類（Pb、As、Cd、Hg）、2A 類（Co、Ni、V）、2B 類（Ag）、3類（Ba、Cr、Cu）、其他（Al、Ca、Fe、Ga、Mn、Rb、Sr、Zn、Na、Mg、K）［6］。其中1類元素和Cu 根據2015年版《中國藥典》 中對甘草等重金屬含有量及有害元素含有量限定標準［7］，26批樣品中，Pb均小于5 mg／kg；As 均小于2 mg／kg；Cd 均小于0.3 mg／kg；Hg 均小于0.2 mg／kg；Cu 均小于20 mg／kg。2A 類元素中Co 均小于0.4 mg／kg，V均小于0.1 mg／kg，參照2015年版《中國藥典》對Ni 的最嚴要求（≤1 mg／kg，輔料硬脂酸、氫化大豆油等），編號4～5、25～26均超過標準。2B 類Ag 均小于0.06 mg／kg，3類中Ba 元素含有量編號25～26明顯高于其他批次，此外這2個批次的Pb、Al、Ca、Mn、Rb、Sr、Zn、Mg、K 均明顯偏高，表明生產這2個批次的四川L 廠在生產工藝上與其他廠家存在明顯差異，原藥材元素轉移進入制劑中的量偏高。參照2015年版《中國藥典》 中對膠囊用明膠中鉻的限值（不得過百萬分之二），編號4的Cr 含有量超標了7倍。

表4 26批樣品根據ICH Q3D 分類1類～3類元素測定結果（mg／kg）Tab.4 Full quantitative results of 1-3 types of elements according to the classification of ICH Q3D in twenty-six batches of samples（mg／kg）

表5 26批樣品中其他11種元素測定結果Tab.5 Full quantitative results of other eleven elements in twenty-six batches of samples

3 討論

本實驗采用微波消解法聯合ICP-MS 對小兒咳喘靈顆粒進行了半定量全元素掃描和全定量測定。半定量測定結果，為全定量中元素種類選擇和對照品溶液濃度配制提供了參考。將2種模式下的定量結果進行比較，半定量能給出較為準確的元素濃度范圍，本實驗中除Ca、Fe、Ga、Na、Mg、K 外，其他元素的準確率均達到80%以上，這可能與參比溶液元素種類以及供試品中元素濃度與之接近程度相關，參比元素種類越多、范圍分布越廣，獲得的半定量結果就越加準確［8］。供試品中如Na、K、Mg、Ca 等常量元素濃度遠遠高于參比濃度，半定量值相對誤差就會偏大。

全定量對照品溶液的配制，直接關系定量結果的準確性，由于各元素間量相差數個數量級，要兼顧痕量、微量、常量元素的準確測定，勢必要擴大標準曲線線性范圍。但考慮到標準曲線的權重，本實驗分2步稀釋，第1次稀釋50倍用于痕量、微量元素測定，在標準曲線中去除最高點（500 ng／mL）再進行線性擬合，第2次再稀釋50倍用于常量元素測定，在標曲中去除最低點（1 ng／mL）后進行線性擬合。所有檢測元素在線性范圍內線性關系良好（r≥0.999 5）。

本實驗參考2015年版《中國藥典》 部分藥材和輔料中對重金屬元素及有害元素的限值規定，發現部分樣品存在Cr、Ni 超標，而且集中在個別廠家，提示該廠家的藥材來源存在問題，也可能在生產過程引入了金屬催化劑鉻和鎳。參照美國NSF／ANSI 173-2010標準中有關“膳食補充劑”原材料中重金屬限值規定（Cr6＋≤2.0 μg／g）［9］，該廠家樣品中毒性較高的Cr6＋是否超標還需進一步確證，可通過聯用液相或離子色譜等方法實現［10］。由于本實驗共定量測定了22種元素，并未全部覆蓋USP 232／233和歐洲藥物評審委員會（EMEA）收載的全部元素雜質及金屬催化劑［11］，如Pt、Ir、Ru、Rh、Os 等，在缺乏相應對照品溶液的情況下，對于一些問題比較突出的樣品，可以單獨進行半定量掃描，驗證有無其他元素殘留。

小兒咳喘靈顆粒的現行標準中并無重金屬及有害元素的限度規定［12-13］，如不對其進行擴大范圍的元素測定，很難發現其他有害元素的殘留。但目前針對中藥制劑的有害元素殘留量并無統一規定，2015年版《中國藥典》 僅對部分中藥限制了Pb、Cd、As、Hg、Cu 的量，ICH Q3D 元素雜質指南亦不適用于中藥制劑，因此建立中藥材和中藥制劑范圍較廣的有害元素限量標準勢在必行。

本實驗建立的ICP-MS 半定量篩查方法準確度較高，操作簡便，與全定量相結合，檢查26批小兒咳喘靈顆粒的元素種類及部分元素含有量，為中藥制劑特別是在成分復雜、有害元素種類未知的情況下，提供范本。也為中藥制劑質量控制及有害元素的快速檢測提供依據。