馬夢雪，吳士筠，李 剛，覃 瑞，董 翔，劉 虹

（中南民族大學生命科學學院，武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北重點實驗室，湖北 武漢430074）

紅花Carthamus tinotoriusL.屬菊科紅花屬的一年生或兩年生草本植物，又名刺紅花、菊紅花和紅花菜等，是一種藥食同源的重要經濟作物［1］。紅花適應性較強，能抗寒、耐旱、耐鹽堿［2］，在世界各地均有分布，哈薩克斯坦和印度是其主產國［3］。在我國，紅花的種植地區幾乎遍布全國25個省市（自治區），河南、四川、浙江、云南和新疆為主產區［4］。紅花的花瓣作為傳統的中草藥始載于《開寶本草》，《本草綱目》 記載其具有活血通經、去瘀止痛的功效［5］。現代藥理研究表明，紅花及其活性成分具有廣泛的生物活性，包括擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、調節免疫系統、抗凝和抗血栓形成、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血脂、鎮痛等［6-10］。黃酮類是其最主要的化學成分，根據結構的不同，可以將其分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮、查爾酮、花色素等。羥基紅花黃色素A 是紅花中主要的查爾酮類，也是其活血化瘀功效的主要有效成分；槲皮素及其苷類蘆丁為黃酮醇類，是其抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用的主要活性成分［11］；木犀草素是具有代表性的天然黃酮，具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種藥理活性［12］，但紅花中木犀草素研究相對較少，花中木犀草素的含有量測定尚未見報道。

中藥質量是對中藥有效性和安全性的反映和表征，劉昌孝等［13］于2016年提出中藥質量標志物這一新概念，它是指存在于中藥材和中藥產品中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關的化學物質。2010年版《中國藥典》 中僅以羥基紅花黃色素A 和山柰素為指標用于紅花藥材的質量控制，不能反映其多成分多靶點的特點，難以全面反映藥材質量［14］。故本研究以黃酮類為主要研究對象，以羥基紅花花色素A、蘆丁、木犀草素和槲皮素為質量標志物，采用HPLC 法同時測定不同品種紅花中4種黃酮類的含有量，以期為紅花優良品種的選育及紅花藥材內在質量的控制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260LC 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；KQ-100E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL-204分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫療器械有限公司）；JK-WB400水浴鍋（上海精密科學儀器有限公司）；溶劑過濾器、0.45 μm 微孔過濾膜、一次性針頭過濾器等（天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 材料 以62份不同品種紅花為材料，種子由中國農業科學院油料作物研究所提供，信息見表1。取材于中南民族大學紅花種植基地，并于實驗室內用鑷子取下花瓣，50 ℃烘箱內烘干至恒定質量，粉碎，過50目篩，備用。羥基紅花黃色素A（批 號 R25A9F59977 ）、槲皮素（批 號C09S8Y43412）、蘆丁（批號Y16M9S61523）、木犀草素（批號C24M8Q36543）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純購于西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司；其他生化試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.5%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～40% A；15～20 min，40%～70% A；20～30 min，70%～10% A）；檢測波長300 nm；柱溫25 ℃；體積流量0.5 mL／min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素、木犀草素對照品2.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL 棕色量瓶中，搖勻，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即為0.1 mg／mL對照品貯備液。準確吸取各對照品貯備液適量于10 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，過濾，取續濾液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備 稱取烘干的紅花樣品粉末（過50目篩）0.3 g 于100 mL 圓底燒瓶中，加入12 mL 60%甲醇溶液，稱定質量，于80 ℃加熱回流40 min，放冷，用60% 甲醇補足減失質量，搖勻，過濾，備用。精密移取2 mL 濾液于10 mL 棕色量瓶中，用60% 甲醇稀釋至刻度，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液適量，依次逐級稀釋，定容，搖勻，制得6個質量溶度梯度的對照品混合溶液。在“2.1”項色譜條件下進樣，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續進樣6次，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積 RSD 分別為 0.530%、0.608%、0.926%、0.930%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 精密稱取安徽紅花粉末（AH-1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件 下，分別于0、6、12、18、24 h 進樣，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積RSD 分別為1.108%、0.486%、1.041%、0.721%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 精密稱取安徽紅花粉末（AH-1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素、槲皮素峰面積RSD 分別為0.803%、1.835%、1.562%、0.678%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 稱取6份已知含有量的紅花粉末，分別精密加入一定質量的羥基紅花黃色素A、蘆丁、木犀草素和槲皮素對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.9 樣品含有量測定 取62份紅花供試品溶液，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液各3份，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算4種黃酮類的含有量，結果見表4。同時，運用SPSS 21.0軟件對4種成分含有量四項指標的數據進行標準化處理，結果見表5。

表4 各成分含有量測定結果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表4 各成分含有量測定結果（， n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（， n=3）

表5 黃酮類成分含有量指標統計量分析（%）Tab.5 Index statistics analysis of flavonoids content（%）

3 討論

3.1 流動相選擇 黃酮類化合物易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑。為了同時檢測紅花中4種黃酮類，同時保證有較好的分離效果，考察了甲醇-水、甲醇-0.4% 磷酸、甲醇-乙腈-0.7%磷酸、甲醇-0.5%乙酸及乙腈-0.5% 乙酸等流動相［15-18］。結果表明，使用前幾種流動相系統時，4種組分與其他成分分離度不高，分離所需時間也較長。在選擇乙腈-0.5%乙酸為流動相梯度洗脫時，4種黃酮類分離效果較好。

3.2 檢測波長選擇 通過對對照品溶液波長的掃描，得到各對照品分別在402、370、350、320 nm處有最大吸收，因此考察這4種波長的檢測靈敏度。結果發現300、350 nm 條件下檢測靈敏度較高，300 nm 作檢測波長較350 nm 的干擾峰小，效果最好。因而選擇300 nm 為最佳檢測波長。

3.3 供試品制備方法考察 采用加熱回流法，以總黃酮的提取率為考察指標，對提取溶劑（20%、40%、60%甲醇）、料液比（1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60）、提取溫度（60、70、80 ℃）和提取時間（60、80、100 min）進行正交試驗考察。結果表明，1.0 g 紅花粉末中加入40 mL 60%甲醇回流提取80 min 時總黃酮的提取得率較高。

3.4 指標成分分析 本研究以4種成分對紅花品質進行多指標分析，由含有量測定結果可知各品種紅花的羥基紅花黃色素A 含有量平均值為0.937%～3.847%，其中僅有YN-14和IND-2的值低于1%，其余60份紅花的羥基紅花黃色素A 含有量均符合2010年版《中國藥典》 不少于1% 的要求。由統計量分析結果可知，羥基紅花黃色素A 含有量平均值為1.817%，最高含有量（3.847%）是最低含有量（0.937%）的4.10倍；蘆丁含有量平均值為0.350%，最高含有量（0.736%）是最低含有量（0.047%）的15.66倍；木犀草素含有量平均值為0.069%，最高含有量（0.142%）是最低含有量（0.016%）的8.875倍；槲皮素含有量平均值為0.788%，最高含有量（1.932%）是最低含有量（0.022%）的87.81倍；4種黃酮類含有量的平均變異系數為42.092%，表明紅花植物種內不同品種之間黃酮含有量存在較大差異，分化明顯，該結果與郭美麗等［19］對紅花種質資源的品質評價的研究結果相似，這為高品質紅花品種的遺傳選育提供了依據。印度紅花（IND-1）、山東紅花（SD-2）、德國紅花（DEU-1）和敘利亞紅花（SYR-1）的羥基紅花黃色素A 含有量最高，分別為3.847%、3.369%、3.202%、2.869%，均高于劉雅新等［20］測得的含有量；而且蘆丁和槲皮素含有量也較高，表明這些地區的紅花資源質量較優，適宜作為紅花育種的候選材料。木犀草素主要存在于植物的葉、莖和枝干中，已在菊花中測得，但在紅花中尚未有相關報道［21］。本研究從花中測得木犀草素，發現其含有量平均值為0.069%，遠遠低于其他黃酮類成分含有量，但是該值與韓煒等［22］在紅花地上部分測得的木犀草素的平均含有量0.0549%相近，表明木犀草素含有量低可能是因為其本就在紅花中含有量相對較少，而與所選取的植物部位無關。由于長期的自然和人工選擇，紅花品種中化學成分和藥理活性在種內發生了變異。一些來源相同的紅花品種其黃酮含有量表現出較大的差異，如源自云南的YN-14，其各項黃酮類成分含有量均低于其他云南紅花。同時，有一些來自不同地區的紅花其黃酮成分含有量表現出相似性，如以色列紅花（ISR-1）與阿根廷紅花（ARG-1），這可能是因為這些紅花資源種植在同一環境條件下時，其在性狀上表現出相似的生態適應性。以上結果表明，不同品種紅花黃酮含有量可能存在顯著性差異，也可能存在相似性，故對紅花中多種黃酮類進行同步測定以更加全面的反映其內在質量。

據現有報道［23-24］，紅花有不同的花色，不同品種紅花在不同的開花時期其花色會發生改變，不同花色的紅花其黃酮類成分含有量和藥效也存在一定的差異，但是相關作用機制的研究報道甚少，亦有待研。