郭 靜，王浩然，沈周媛，張 彤，袁秀榮，丁 越?

（1.上海中醫藥大學，上海201203；2.徐州市夏橋社區衛生服務中心，江蘇 徐州221011）

我國竹類資源豐富，是世界上最主要的產竹國，目前已收載了原產及少數引進的竹亞科植物43屬707種、52變種及98變型［1］，其中《中國中藥資源志要》 上列出了30余種藥用竹種，包括常見的禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn.、大明竹屬植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.、剛竹屬植物淡竹（又名毛金竹）Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等［2-3］，其中淡竹葉的莖葉稱淡竹葉，苦竹的葉稱苦竹葉，而淡竹等的葉則被統稱為竹葉，在我國擁有極其悠久的藥用和食用歷史。淡竹葉主要分布于長江以南各省區，有清熱瀉火、除煩利尿的功效，經炮制干燥后使用，主治熱病煩渴、口瘡尿赤、熱淋澀痛等癥。其小塊根亦作藥用。苦竹葉分布于江蘇、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、四川等地，具有清心解毒、利尿明目之功效，以嫩葉入藥，常用于熱病煩渴、失眠、小便短赤、口瘡、目痛、失音、燙火傷。竹葉主要分布于山東、河南及長江流域以南各地，具有清熱除煩、生津利尿之功效，隨時采鮮品入藥，多用于治療熱病煩渴、小兒驚癇、咳逆吐衄、小便短赤、口糜舌瘡。其筍可供食用，中藥之“竹茹”“竹瀝”一般取自本種。

近年來，由于竹葉保健作用明顯、安全性高，常被開發成色、香、味俱佳的保健產品，如竹葉酒、竹葉茶等，具有提高機體免疫力、抑菌殺菌、清除氧自由基等功效［4］。竹葉中含有大量的黃酮、酚酸、多糖、氨基酸及微量元素等，其中以黃酮和酚酸居多，是竹葉的主要活性物質［5-7］。竹葉中黃酮類多屬于黃酮碳苷和黃酮氧苷，主要有苜蓿素、日當藥黃素、木犀草素、木犀草苷、異葒草苷、葒草苷等；酚酸類主要包括香豆酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸等［8-13］。現代藥理研究證明，竹葉具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、降血脂等作用［14-21］，其中黃酮、酚酸類表現出較強的藥理活性，具有顯著的抗氧化活性。目前以竹葉黃酮、內酯和酚酸類為主的竹葉抗氧化劑（AOB）已列入國標GB-2760，被衛生部批準作為天然食品抗氧化劑使用，在北美和亞洲等地區已安全應用于食品、保健品、醫藥、化妝品的開發［22-24］，具有廣闊發展前景。

竹葉具有顯著的抗氧化活性，市場應用極為廣泛。但是，由于竹葉品種繁多、性狀相近、功效相似、成分復雜，目前尚無系統有效的鑒別方法，即便是納入《中國藥典》 的淡竹葉也缺少成分含有量測定的質量控制標準［25-26］，更缺乏對其抗氧化活性的物質基礎研究。本研究采用DPPH 法、ABTS 法及FRAP 法對其活性成分進行抗氧化活性研究，根據其適用性、穩定性與可重復性優選出DPPH 法用于3種竹葉提取物的抗氧化活性評價，再通過指標成分含有量與提取物抗氧化活性的相關與回歸分析，初步探討3種竹葉中的抗氧化活性物質基礎，以期為竹葉資源的合理利用和健康產品的有效開發奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 series 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JA31002電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；DHG-9053A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多中國）；JP-300B 高速多功能粉碎機（浙江永廉市久品工貿有限公司）；SB5200D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；微孔板分光光度計（美國Bio Tek 公司）。

1.2 藥物和試劑 1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（美國Sigma 公司）；L-抗壞血酸（國藥集團化學試劑有限公司）；維生素E 類似物（上海碧云天生物技術有限公司）；綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品（上海源葉生物科技有限公司）。FRAP 法總抗氧化能力檢測試劑盒、ABTS 快速法總抗氧化能力檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，安徽時聯特種溶劑股份有限公司）。

實驗中所用3種竹葉經上海中醫藥大學宋龍博士鑒定為禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn.的干燥葉及根莖、禾本科植物苦竹Pleioblastus amarus（Keng）keng f.的干燥葉、禾本科植物淡 竹Phyllostachys nigra（Lodd.）Munro var.henonis（Mitf.）Stapf ex Rendle 等的干燥葉。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 分別取綠原酸、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品約5 mg，精密稱定，甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得到約0.5 g／L 的對照品溶液，同法配制約1 g／L 的異葒草苷、葒草苷、異牡荊素對照品溶液。分別精密量取綠原酸1 mL、異葒草苷2.5 mL、葒草苷2 mL、異牡荊素2 mL、木犀草苷0.2 mL、木犀草素0.2 mL、芹菜素0.1 mL，混合后加50%甲醇定容至10 mL，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 HPLC 待測樣品 取各竹葉粉末（過65目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入甲醇25 mL，室溫超聲提取30 min，冷卻至室溫，10 000 r／min 離 心10 min，取上清液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 抗氧化活性待測樣品 待測提取液的前處理方法同HPLC 待測樣品的制備，所得提取液還需經適當濃縮或稀釋配制成系列質量濃度待測液。另取綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素對照品及L-抗壞血酸、維生素E 類似物陽性抗氧化物各約1 mg，精密稱定，分別加適量DMSO 溶解，配制成20 mmol／L 的對照品溶液，再分別加50%甲醇稀釋成系列濃度的成分待測液。

2.2 7種成分含有量測定 按2015年版《中國藥典》 中藥質量標準研究制定要求，結合預試驗中成分含有量、分離度、專屬性等考察結果，最終確定以綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、木犀草苷、木犀草素、芹菜素作為竹葉測定指標，并建立了一種可用于3種竹葉中7種成分含有量測定方法。色譜條件，Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，10% B；2～30 min，10%～30% B；30～45 min，30%～70%B；45～55 min，70% B；55～60 min，70%～10%B）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長350 nm；進樣量10 μL。每個樣品平行測定3次。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 各成分對DPPH 自由基的清除活性 新鮮配制6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分別加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同濃度的成分待測液10 μL 加入，搖勻后加入甲醇140 μL，于室溫避光反應1 h，在517 nm 處測定吸光度為A樣品；未加待測液的的空白DPPH 溶液（10 μL 甲醇）的吸光度為A空白。每份樣品各平行測定3次，取平均值。樣品對DPPH 的清除率可表示為

采用SPSS v21.0軟件，以成分濃度和相應的清除率計算其IC50，單位mmol／L。

2.3.2 各成分對ABTS 自由基的清除活性 根據ABTS 試劑盒說明書配制ABTS 工作液，稀釋過氧化氫和過氧化物酶溶液，以維生素E 類似物為標準品配制系列濃度溶液，構建標準曲線。96孔板中先加入20 μL 過氧化物酶工作液，再加入10 μL各成分待測液和ABTS 工作液170 μL 輕輕混勻，室溫孵育6 min 后測定414 nm 處吸光度，根據標準曲線計算待測成分的抗氧化值。

2.3.3 各成分對鐵離子的還原能力 按照FRAP試劑盒說明書配制適量的FRAP 工作液，并以FeSO4·7H2O 為標準品配制系列濃度溶液，構建標準曲線。96孔板中先加入180 μL FRAP 工作液，再加入5 μL 各成分待測液混勻，37 ℃孵育3～5 min后測定593 nm 處吸光度，根據標準曲線計算其抗氧化值。

2.3.4 各竹葉提取物對DPPH 自由基的清除活性 新鮮配制濃度為6.5×10-5mol／L 的DPPH 甲醇溶液，在96孔板中分別加入DPPH 甲醇溶液100 μL，再取不同濃度的待測提取液10 μL 加入，搖勻后加入甲醇140 μL 于室溫避光反應1 h，在517 nm 處測定吸光度并按上述公式計算待測提取液對DPPH自由基的清除率，并采用SPSS 21.0軟件計算其IC50，單位mg／mL。

3 結果

3.1 不同竹葉中7種成分的含有量測定及抗氧化活性測定

3.1.1 線性關系考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液加50% 甲醇逐次稀釋2倍，注入HPLC 測定，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸。結果見表1。7種成分及其在不同竹葉樣品中的高效液相色譜圖見圖1。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various components

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various components

3.1.2 不同竹葉中7種成分的含有量及其抗氧化活性 分別測定了7批淡竹葉、10批苦竹葉和9批竹葉提取物及7種成分的抗氧化活性，結果見表2～3，結果均表示為（）。不同竹葉提取物清除DPPH 自由基的IC50均值比較結果如圖2。其結果表明竹葉提取物的抗氧化活性最強，苦竹葉次之，淡竹葉最弱，竹葉和苦竹葉清除DPPH 自由基的能力約為淡竹葉的2～3倍，且淡竹葉的抗氧化活性與竹葉、苦竹葉比較均具有顯著的統計學差異（P＜0.05）。

圖2 3種竹葉提取物清除DPPH 自由基的能力Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of the extracts from three kinds of bamboo leaves

3.2 雙變量相關性分析

3.2.1 雙變量相關性分析 采用雙變量相關性分析分別對3個品種竹葉中7種成分的含有量與對應品種提取物的抗氧化活性的相關性進行了分析，分析結果見表2所示。其結果表明，芹菜素含有量與淡竹葉提取物抗氧化活性呈顯著正相關（P＜0.05），綠原酸、異葒草苷含有量與苦竹葉提取物抗氧化活性呈極顯著正相關（P＜0.01）；葒草苷含有量與竹葉提取物抗氧化活性呈極顯著正相關（P＜0.01），即綠原酸、異葒草苷、葒草苷和芹菜素含有量與3種竹葉提取物抗氧化活性具有顯著的相關性（P＜0.05）。但由于提取物活性通常是各成分總體作用的結果，僅通過相關性不能直觀的根據各成分的含有量預測樣品的抗氧化活性，還需進一步回歸分析。

表2 各成分的抗氧化活性及相關性分析結果Tab.2 Results of antioxidant activities of various components and correlation analysis

3.2.2 逐步回歸分析 利用SPSS v21.0統計軟件對成分含有量數據及提取物清除DPPH 自由基的抗氧化活性進行逐步回歸分析（“Entry”=“0.15”，“Removal”=“0.20”）［27-28］，結果顯示，淡竹葉中葒草苷、芹菜素含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關（P＜0.01）；苦竹葉中異葒草苷含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關（P＜0.01）；竹葉中葒草苷含有量與其提取物清除DPPH 自由基的能力呈極顯著正相關（P＜0.01）。綜合前述回歸分析與相關性分析結果，初步確定淡竹葉、苦竹葉、竹葉提取物中的主要抗氧化活性成分，其中淡竹葉抗氧化活性主要與芹菜素相關；苦竹葉抗氧化活性主要與異葒草苷相關；而竹葉抗氧化活性主要與葒草苷相關。此外，本研究還對各指標成分含有量、含有量之和共8個自變量與因變量提取物抗氧化值（IC50）進行了回歸分析，初步得到了不同品種竹葉抗氧化活性與各成分含有量的回歸方程，見表4，其中A表示提取物清除DPPH 自由基活性，Cn表示相應成分的含有量。將各成分含有量數據代入表中的回歸方程進行抗氧化活性的預測和模擬，見圖3。結果表明，所觀測的抗氧化活性值與實測的抗氧化活性值趨勢基本一致，均呈正相關，且淡竹葉回歸方程預測效果最好（R=0.984），有望經過后續進一步的試驗驗證，應用于淡竹葉抗氧化活性的快速推測。

表3 各成分含有量測定結果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

表3 各成分含有量測定結果及其抗氧化活性（， n=3）Tab.3 Results of content determination of various components and their antioxidant activities（， n=3）

注：-表示未檢測出。IC50表示清除50%DPPH 自由基時所對應的提取物濃度

表4 成分含有量與提取物抗氧化IC50值的逐步回歸結果Tab.4 Results of stepwise regression analysis between content of components and antioxidant IC50values of extracts

圖3 回歸方程模擬結果Fig.3 The simulation results of regression equations

4 討論

研究中常用的抗氧化活性評價方法為DPPH自由基清除法，ABTS 自由基清除法，鐵離子還原能力（FRAP）法及羥自由基清除法等［29-31］。本研究分別以ABTS 法、DPPH 法和FRAP 法考察了3種竹葉7種成分的抗氧化活性，其中ABTS 法測定結果表明綠原酸抗氧化能力最強，而芹菜素最弱；DPPH 法結果表明異葒草苷抗氧化活性最強而芹菜素最弱；FRAP 法結果表明木犀草素抗氧化活性最強而芹菜素最弱。3種方法測定結果均表明7種成分中以芹菜素抗氧化活性最弱，但對其中成分較強的化合物的抗氧化活性測定結果不盡相同，可能與3種測定方法的工作機理、測試環境、待測物在測試溶劑中的溶化性等相關。經實驗研究及結果分析發現，FRAP 法中以FeSO4·7H2O 為對照品，其反應體系主要為水，而黃酮類難溶于水，在水環境下會析出沉淀，影響實驗測定結果，故FRAP 法不適用于竹葉提取液中黃酮類的抗氧化活性測定；ABTS 法測定過程中需要使用過氧化物酶，而過氧化物酶屬蛋白質類，易受到有機試劑的影響而失活。本研究在預試驗中采用ABTS 法測定提取物的抗氧化活性時，結果較不穩定，重復性差，故ABTS 法不適合作為本實驗中提取物的抗氧化活性評價方法；而DPPH 法中的DPPH 本身是種很穩定的氮中心的自由基，易溶于甲醇、乙醇，其體系彈性更大，能更好的使竹葉中的主要成分充分發揮清除自由基的作用，且DPPH 法穩定性好，可重復性強，數據準確、可靠。因此，本研究最終選用了DPPH 法。

近年來，學者們提出了中藥譜效學的研究思路，并在采用數據分析技術預測成分藥效、闡明各成分對藥效貢獻率、尋找主要活性成分方面取得了一定的進展［32］。本研究采用雙變量相關分析與多元回歸分析2種常用方法將樣品中7種成分含有量與3種竹葉提取物抗氧化活性相關聯，找出其中與活性密切相關的變量，初步闡明了其藥效物質基礎，并通過回歸方程對樣品的抗氧化活性進行了模擬，基本與實測結果趨勢保持一致，有望通過該方程的進一步驗證，快速推測竹葉樣品的抗氧化活性，為3種竹葉原藥材的快速篩選與健康產品的合理開發提供參考。