HPLC 法同時(shí)測(cè)定兩粵黃檀中6種成分

宋 舸，韋建華，陳 瑾，張妍妍，王慧敏，馮 旭

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

兩粵黃檀Dalbergia benthamiiPrain.為蝶形花亞科黃檀屬植物，藤本，有時(shí)為灌木。枝長(zhǎng)，干時(shí)黑色，具有通經(jīng)活血的作用，常用于治療跌打損傷、筋骨疼痛等［1］。張禮行等［2］通過(guò)GC-MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)其中含有丁香酚甲醚、異丁香酚甲醚、欖香素等10種成分。韋建華等［3］通過(guò)柱色譜、重結(jié)晶等方法分離獲得14個(gè)化合物。霍麗妮等［4］對(duì)比95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位有相對(duì)優(yōu)異的抗氧化能力，并通過(guò)與阿卡波糖的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用。陳思思等［5］用二倍稀釋法考察發(fā)現(xiàn)兩粵黃檀粗提物具有一定的抗菌作用，通過(guò)二甲苯、雞蛋清致模型腫脹發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗炎作用。鑒于兩粵黃檀中相關(guān)活性成分復(fù)雜，單一含有量測(cè)定難以達(dá)到質(zhì)量控制的要求。因此，本研究建立了兩粵黃檀中6種成分含有量同時(shí)測(cè)定的方法，以期為其質(zhì)量控制提供更加全面、科學(xué)的依據(jù)。

1 材料

TGL-16B 高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TM-D 24UV 超純水儀（德國(guó)Millipore 公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（VWD 檢測(cè)器，四元高壓梯度泵，美國(guó)安捷倫公司）；SQP 電子天平［德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

甘草酸對(duì)照品（批號(hào)G-003-191220）、甘草次酸對(duì)照品（批號(hào)G202002）購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司；土甘草A 對(duì)照品、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮對(duì)照品、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚對(duì)照品［3，6］、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯對(duì)照品［3，7］（自制，歸一化法含有量在98%以上）。氯仿（分析純，西隴化工股份有限公司）；水為超純水；乙腈（德國(guó)默克公司）、甲醇（Fisher）、磷酸（西隴化工股份有限公司）均為色譜純。兩粵黃檀，信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒定為豆科植物黃檀屬兩粵黃檀Dalbergia benthamiiPrain.植物的莖。打粉過(guò)40目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters-symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-甲醇（B）-0.2%磷酸（C），梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，加甲醇定容。配制各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為甘草酸1.25 mg／mL、土甘草A 0.573 mg／mL、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮0.276 mg／mL、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚 0.124 mg／mL、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯0.120 mg／mL、甘草次酸0.180 mg／mL。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取藥材粉末1.0 g，精密加20 mL 氯仿，超聲（200 W、40 kHz）60 min，冷卻后用氯仿補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過(guò)，精密量取2 mL 濾液揮干后用甲醇定容至2 mL，微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。結(jié)果見(jiàn)表3。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［8］。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯、甘草次酸峰面積RSD 分別為0.54%、0.34%、0.45%、1.3%、0.45%、0.53%。表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)S7），在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯、甘草次酸RSD 分別為0.82%、0.51%、0.68%、0.60%、0.52%、1.4%。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份兩粵黃檀藥材（批號(hào)S7）平行3次，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯、甘草次酸含有量RSD 分別為 0.78%、0.81%、0.85%、1.7%、0.84%、0.80%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取9份（批號(hào)S7，每份約0.50 g），分別按照藥材含有量的50%、100%、150%加入混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度分別為0.591 6、0.263 4、0.130 8、0.058 6、0.056 8、0.085 3 mg／mL）5.00、10.00、15.00 mL［6］。精密加入甲醇至20 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.8 樣品含有量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的兩粵黃檀藥材樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算各產(chǎn)地6種成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 前期本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩粵黃檀氯仿部位進(jìn)行液相分離制備獲得7種成分，對(duì)4種未知成分分別鑒定為甘草酸、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯、甘草次酸。3種已知成分為土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、異甘草素［3］，其中異甘草素于6 min 出峰不能與其他雜質(zhì)峰完全分離且含有量較少，無(wú)法達(dá)到分析要求。而甘草酸、土甘草A、4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮、大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯、甘草次酸，各成分在各產(chǎn)地含有量均符合分析要求，故將該種成分作為分析指標(biāo)。

3.2 供試品制備方法

3.2.1 提取溶劑 分別采用水、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿，7種溶劑進(jìn)行考察。分別計(jì)算6種成分的含有量。其中，氯仿提取效果較好。

3.2.2 提取條件 分別采用超聲、回流、冷浸3種方法，相同體積氯仿提取進(jìn)行考察。計(jì)算6種成分的含有量。其中超聲提取和回流提取效果較好，但超聲提取效果略好于回流提取。

3.2.3 提取時(shí)間 分別用氯仿進(jìn)行30、60、90、120 min 超聲提取，計(jì)算6種成分的含有量。其中超聲60 min 和120 min 提取效果較好且接近，綜合其他因素考慮選用60 min 提取較為合理。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

表5 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

3.2.4 料液比 分別考察了1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50不同料液比。計(jì)算6種成分的含有量。其中1 ∶20的含有量均明顯高于其他比例。

3.3 測(cè)定條件選擇

3.3.1 色譜柱 本實(shí)驗(yàn)分別采用依利特、Waters、熱電、Inerstil 等不同廠家色譜柱，其中Waters 分離效果最好，重復(fù)性好，故采用該色譜柱。

3.3.2 流動(dòng)相 由于各成分極性差異較大，等度洗脫難以達(dá)到分離要求，所以采用梯度洗脫，其中甲醇和0.2%磷酸梯度洗脫雖然達(dá)到分析要求，但保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所以采用乙腈、甲醇、0.2% 磷酸3相梯度洗脫。

3.3.3 測(cè)定波長(zhǎng) 將供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)6種成分各最大吸收波長(zhǎng)（甘草酸251 nm；土甘草A 260 nm；4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮256 nm；大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚270 nm；大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯270 nm；甘草次酸264 nm）及各產(chǎn)地6種成分含有量差異、各峰峰形等，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm［9］。

4 結(jié)論

中藥成分復(fù)雜多樣，研究單一成分難以對(duì)其定性定量分析，不能全面的對(duì)中藥材進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量控制，所以本實(shí)驗(yàn)采用多成分定量分析［10］。其中采用HPLC 定量測(cè)定干擾較少、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)兩粵黃檀藥材當(dāng)中的6種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。結(jié)果表明，各產(chǎn)地成分差異較為明顯，其中4′-羥基-6-羥甲基-5，7-二甲氧基異黃酮含有量差異非常明顯；藥材中所含的新黃酮類(lèi)化合物為大魚(yú)藤樹(shù)素甲醚、大魚(yú)藤樹(shù)酸甲酯等，目前研究發(fā)現(xiàn)具有新黃酮類(lèi)母核的化合物具有較強(qiáng)的藥理活性［11-12］。后續(xù)將結(jié)合藥效學(xué)進(jìn)行研究，以期為兩粵黃檀質(zhì)量控制方法的建立，提供一定的科學(xué)依據(jù)。