參麥注射液對阿霉素所致心肌炎癥損傷的保護作用

潘星宇，楊 林，張 升?

（1.海寧市第二人民醫院，浙江 海寧314419；2.浙江省醫學科學院，浙江 杭州310013）

阿霉素（Doxorubicin，DOX），又稱多柔比星，是臨床上廣泛用于治療各類惡性腫瘤的蒽醌類化療藥物。然而嚴重的劑量依賴性心臟毒副作用影響了阿霉素的臨床使用空間［1-2］。阿霉素致心臟毒性的機制尚不完全清楚，傳統研究認為，阿霉素的心臟毒性主要因為阿霉素在體內代謝后生成半醌自由基，進而接到氧自由基損傷心肌細胞［3］。而在近些年的研究中發現，阿霉素誘導的心肌組織炎癥在阿霉素心臟毒性機制中發揮著重要的作用［4］。

參麥注射液（Shenmai Injection，SMI）源于參麥散名方，由人參、五味子、麥冬組成，經現代制劑工藝加工成的注射制劑。具有益氣固脫，養陰生津的作用，現代藥理學證明參麥注射液具有抗氧化應激和抗炎的作用［5-6］。臨床上參麥注射液被廣泛用于治療心腦血管疾病，因此本實驗通過研究參麥注射液拮抗阿霉素誘導的心肌炎癥損傷來揭示參麥注射液的抗炎作用，并通過研究NF-κB 通路的變化揭示在參麥注射液的抗心肌炎分子機理。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康SD 大鼠，50只，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司供應。動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養于溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%的條件下。在整個試驗期間，大鼠自由飲水，喂養60Co 輻照的全價營養顆粒飼料，由南京安立默科技有限公司生產供應。

1.2 試藥 阿霉素由武漢遠成共創科技有限公司生產，含有量為99%，批號20170723。參麥注射液購自于正大青春寶藥業有限公司，批號1804205。IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒產自武漢華美科技有限公司；p-NF-κB、NF-κB 一抗由CST 生產，β-actin 一抗、HRP 二抗購自于上海碧云天公司。

1.3 儀器 電泳儀為Bio-rad 垂直電泳槽；顯影儀（上海勤翔科學儀器有限公司，ChemiScope）；生化儀（日本日立公司）；心臟超聲檢測系統（加拿大，Vevo 1100）。

2 方法

2.1 分組及給藥 50只健康SD 大鼠，雌雄各半，隨機分為正常組、模型組（15 mg／kg 阿霉素）及參麥注射液低、中、高劑量組（0.1、0.3、1 g／kg），每組10。對照組按1 mL／100 g 劑量于實驗第1、3、5、7天分別給予生理鹽水；模型組實驗第1、3、5天給予等容量的生理鹽水，于第7天給予阿霉素15 mg／kg；參麥注射液組于實驗第1、3、5天給予不同劑量（0.1、0.3、1 g／kg）的參麥注射液，于第7天給予阿霉素15 mg／kg。所有組動物于靜脈注射阿霉素72 h 后（實驗第10天）麻醉做心臟超聲檢查。超聲檢查結束后腹主動脈收集各大鼠外周血用于血清心肌酶檢測；血液收集后處死大鼠收集各組大鼠心臟備用。

2.2 心臟功能超聲檢測 各組動物檢測時通過吸入3%濃度的異氟烷進入麻醉，繼而以吸入1%濃度的異氟烷維持麻醉。動物麻醉后，背位固定，左胸前區脫毛待檢。當大鼠心率趨于持續性、穩定性時開始檢測，在進行超聲過程中保持大鼠正常的生理狀態。以高頻探頭進行定位，將探頭至于左胸部，取胸骨旁短軸切面，置于二尖瓣腱索水平，M模式超聲心動評價心臟運動，分別檢測心率（HR）和心搏出量（CO），計算射血分數［EF（%）］。

2.3 血清生化學檢測 各組大鼠外周血收集后，靜止30 min 后，2 500 r／mim 離心15 min，收集上清。使用日立全自動血清生化儀檢測血清中的心肌相關酶（AST、LDH、CK-MB）。

2.4 心臟組織中炎癥因子檢測 取各組大鼠心臟0.1 g，加入1 mL 生理鹽水后勻漿，1 500 r／min離心后收集上清液。按試劑盒步驟進行ELISA測定。

2.5 炎癥通路相關蛋白檢測 各組大鼠剪取各心臟組織約0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，組織勻漿機充分勻漿，裂解30 min 后，12 000g／mim 離心10 min，收集上清。采用BCA 法進行蛋白定量。總蛋白經SDS PAGE 分離后，轉移到PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST 洗膜3次，使用TBST 稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育90 min，TBST 洗膜3次后用化學發光法顯影，采用Image J 軟件進行條帶分析。

2.6 統計學分析 采用Excel 和SPSS 統計分析進行數據處理，計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析；多重比較用LSD 法，P＜0.05差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 參麥注射液對大鼠心肌功能的影響 正常組大鼠心臟大小正常，心肌厚度均一，心臟搏動有力、平穩，心包無積液，未見心房與靜脈回流；模型組大鼠可見心室肌增厚，心臟搏動減慢且出現搏動不規律，偶見靜脈回流；參麥注射液組大鼠心肌增厚現象消失，心臟搏動恢復正常，未見心包積液或靜脈回流。與正常組比較，模型組大鼠心率、心搏出量、射血分數顯著降低（P＜0.01）；參麥注射液（0.3、1 g／kg）組大鼠心率、心搏出量、射血分數顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

3.2 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響 與正常組比較，模型組心肌酶指標（AST、LDH、CKMB）水平顯著上升（P＜0.01）。與模型組比較，參麥注射液高劑量組心肌酶指標水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；中劑量組LDH、CK-MB 水平均顯著下降（P＜0.05）。見表1。

表1 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

表1 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

圖1 參麥注射液對大鼠心肌功能的影響（n=10）Fig.1 Effects of SMI on myocardial function in rats（n=10）

圖2 參麥注射液對大鼠心肌組織中炎癥因子的影響Fig.2 Effects of SMI on myocardial inflammatory factors in rats

3.3 參麥注射液對大鼠心肌炎癥因子的影響 圖2表明，與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中促炎因子IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10水平顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，參麥注射液高劑量組能顯著逆轉以上炎癥因子水平（P＜0.05，P＜0.01）；而參麥注射液低、中劑量組能明顯上調IL-10水平（P＜0.01）。

3.4 參麥注射液對大鼠心肌組織NF-κB 磷酸化的影響 與正常組比較，模型組p-NF-κB 蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；經參麥注射液干預后，給藥組大鼠心臟組織內p-NF-κB 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

4 討論

阿霉素作為蒽醌類藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性，但也同時因為存在急性、亞慢性和慢性的心臟毒性使臨床使用受限［8］。參麥注射液源于《病因脈治》 中的參冬飲。主要用于益氣固脫，養陰生津，生脈。用于治療氣陰兩虛之冠心病、病毒性心肌炎和慢性肺心病。參麥注射液是中國傳統醫學與現代制劑工藝結合產生的中藥注射劑，臨床上用于治療心血管疾病。同時參麥注射液能夠提高腫瘤病人的免疫機能，與化療藥物合用時有增效作用，因其自身也具有一定的抗腫瘤活性，在臨床上常用于抗腫瘤的輔助用藥［7］。本研究也驗證了參麥注射液聯合化療藥物使用時能夠保護心臟組織，為中醫藥臨床研究提供了臨床前實驗數據，指導臨床對參麥注射液的開發使用。

圖3 參麥注射液對大鼠心肌組織p-NF-κB 蛋白表達的影響（n=10）Fig.3 Effects of SMI on the expression of p-NF-κB protein in rat myocardia（n=10）

阿霉素誘導的心臟毒性機制具有多樣性的特點，尚未完全明確。一般認為氧化應激是阿霉素心臟毒性的主要毒理機制，而其他如細胞代謝異常，損傷細胞線粒體和炎癥反應也被視為阿霉素誘導心肌損傷的重要因素［9］。事實上，臨床中發現阿霉素的使用能夠激活機體固有免疫，釋放炎癥因子導致心臟病理性改變［10］。參麥注射液通過提高機體免疫功能，降低炎癥因子的釋放，改善心肌組織炎癥反應保護心肌組織［11］。本實驗一次性注射給予15 mg／kg 阿霉素造成大鼠急性心臟毒性，心肌組織中IL-6和TNF-α 等促炎因子升高和IL-10抗炎因子降低。IL-6和TNF-α 可通過增加中性粒細胞和吞噬細胞的功能，激活大量的過氧化物陰離子，從而引發自由基攻擊細胞膜及其細胞器的磷脂膜，導致心肌細胞損傷。又由于心肌細胞本身不具有再生的功能，心肌細胞損傷容易誘發心臟收縮和舒張障礙，心率（HR）下降，心肌泵血能力（CO、EF）降低等心臟功能異常。在大鼠外周血血清中檢測到AST、LDH 和CK-MB 等心肌酶升高也證實了阿霉素的急性損傷作用。而提前給予參麥注射液的大鼠，上述癥狀均有顯著改善，且部分指標具有劑量依賴性。參麥注射液能夠通過減少炎癥反應，保護心肌細胞，恢復心肌功能來拮抗阿霉素誘導的心臟毒性。

NF-κB 信號通路是細胞內最為重要的炎癥誘導分子通路。使促炎因子TNF-α 和白介素等胞外信號均能引起NF-κB 通路的激活的激活。NF-κB 蛋白是調控細胞炎癥的關鍵轉錄因子，其P65亞基的磷酸化是NF-κB 激活的標志［12］。本研究發現，大鼠給予阿霉素72 h 后，心臟組織內NF-κB 的磷酸化程度升高，提示NF-κB 信號通路激活。參麥注射液能夠通過降低阿霉素升高的p-NF-κB，阻斷NF-κB 信號通路啟動，減少炎癥的產生，提示參麥注射液的抗炎作用與抑制NF-κB 通路有關。此外，NF-κB 信號通路的激活對腫瘤的轉移具有明顯的促進作用［13］，參麥注射液能抑制阿霉素升高的NFκB 磷酸化，也提示了參麥注射液能夠有效輔助阿霉素治療腫瘤的惡性轉移。

綜上所述，參麥注射液能夠有效的拮抗阿霉素誘導的心肌損傷，且這種保護作用體現在抑制阿霉素誘導的心肌炎癥的產生，保護心肌功能，并調控NF-κB 信號通路抑制細胞內炎癥通路的激活。因此，參麥注射液在臨床上能夠作為阿霉素抗腫瘤的輔助用藥。