五味子乙素對大鼠心室肌細胞鈉電流的影響

鄒 麗王秀秀錢 薇楊蘊智葛 焱許正新

（1.揚州大學醫學院，江蘇 揚州225000；2.江蘇省重點動物傳染病和人畜共患病預防控制共創中心，江蘇 揚州225001；3.江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室，江蘇 揚州225001；4.江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室，江蘇 揚州225009）

五味子，木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，性味酸甘溫，具有寧心安神的功效，主治心神失養之虛煩心悸，失眠多夢等癥狀。傳統中藥五味子以顯著的保肝作用而廣泛應用于臨床［1-2］。現代藥理學研究發現，五味子對中樞神經系統［3］、心腦血管系統［4-5］、免疫系統［6］亦有良好作用。劉菊秀等［7］的研究結果提示，適當劑量的五味子具有減弱心收縮力，減慢心率的作用。成分分析結果顯示，五味子含揮發性成分、木脂素和有機酸等［8］。其中，屬于聯苯環辛烯木脂素類的五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）具有許多有應用前景的藥理作用［9］。胡開永等［10］報道，五味子乙素對阿霉素引起的心肌毒性具有保護作用；孫紅霞等［11］研究發現，五味子乙素對大鼠離體心臟缺血再灌注（I／R）損傷具有一定保護作用。眾所周知，藥物引起的心臟毒性、心臟缺血再灌注損傷等一系列作用的產生與離子通道密切相關，因此探索五味子乙素與離子通道之間的關系具有很重要的現實意義。本實驗應用全細胞膜片鉗技術，探究五味子乙素對大鼠心室肌細胞除極相的主要通道電流—鈉離子通道電流（INa）的影響。闡述五味子乙素與鈉通道有無關聯，并為其今后的開發利用及更好地服務于臨床提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠（250±20）g，雌雄不拘，揚州大學比較醫學中心提供 ［SCXK（蘇）2017-0044］。

1.2 試藥 五味子乙素（成都埃爾法生物科技有限公司，含有量為98%，批號405A096）；膠原酶Ⅱ（Worthington 公司，批號44N15308B）；肝素鈉（Solarbio 公司，批號301A028）；Glucose（Solarbio公司，批號405A096）；EGTA（Fluka 公司，批號101257840）；BSA（albumin from bovine serum，牛血清白蛋白，ICN 公司，批號8398F）；Taurine（牛磺酸，Sigma 公司，批號101282014）；CsCl（Sigma 公司產品，批 號 101368097）；TEA-Cl（Sigma 公司，批號101394223）；MgATP（Sigma公司，批號1001571838）；HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸，Sigma 公司，批號1001621577）；TTX（Tetrodotoxin，河豚毒素，Affix 公 司，批 號AF02）；其余均為國產分析純。

1.3 儀器 EPC-10 USB／Patchmaster 單通道膜片鉗放大器，德國Heka 公司；IX71倒置科研級顯微鏡，日本Olympus 公司；MP-225顯微操作器系統，美國Sutter 公司；P-97微電極拉制儀，美國Sutter公司；防震臺，美國TMC 公司；硼硅酸鹽玻璃電極（外徑1.5 mm，內徑1.05 mm），武漢微探有限公司。

2 方法

2.1 溶液配制 臺氏液為NaCl 135 mmol／L，KCl 5.4 mmol／L，NaH2PO40.33 mmol／L，MgCl21.0 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，Glucose 10.0 mmol／L，用NaOH 調pH 為7.30～7.40；無鈣臺氏液為臺式液除去CaCl2，即可；酶溶液為無鈣臺氏液中加入0.4 g／L 膠原酶Ⅱ，1 g／L 的BSA，0.4 g／L Taurine 和30 μmol CaCl2；KB 液 為Lglutamic acid 70.0 mmol／L，KCl 25.0 mmol／L，Taurine 10.0 mmol／L，NaH2PO410.0 mmol／L，EGTA 0.5 mmol／L，Glucose 11.0 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，KOH 89.0 mmol／L，用KOH 調pH 為7.30～7.40；電極內液為CsCl 133.0 mmol／L，NaCl 為5.0 mmol／L，TEACl 20.0 mmol／L，EGTA 10.0 mmol／L，HEPES 10.0 mmol／L，MgATP 5.0 mmol／L，用CsOH 調pH為7.25～7.30；細胞外液為NaCl 135.0 mmol／L，CsCl 5.4 mmol／L，MgCl21.0 mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，HEPES 5.0 mmol／L，Glucose 10.0 mmol／L，CdCl20.1 mmol／L，用NaOH 調節pH 至7.30～7.40。

五味子乙素，以二甲基亞砜（DMSO）配制成100 μmol／L 的母液凍存，使用時用相應的細胞外液分別稀釋成終濃度為1、2、3、10、30 μmol／L。

實驗采用自身對照，按刺激方案引導、記錄五味子乙素灌流前INa（對照組），待電流穩定后分別給予不同濃度的五味子乙素灌流，并記錄INa的變化。為最大化地減小因細胞大小帶來的實驗誤差，用電流密度表示電流值，單位pA／pF。

2.2 大鼠心室肌細胞的分離 大鼠心室肌細胞分離參照文獻并略作改善［12］。大鼠麻醉，仰臥位固定，開胸暴露心臟并于降主動脈段快速將其剪下。排出殘血、稍作修剪后迅速將主動脈插入改良過的Langendorff 灌注架上。0.4 g／L 膠原酶Ⅱ灌流消化20～30 min，直到心臟變軟、滴速變快、流出液渾濁并有粘稠感時停止消化，整個過程保持37 ℃并持續通氧。消化結束后取下心臟剪碎，用100目濾網過濾得到單個心室肌細胞，充氧半小時并室溫避光放置2～3 h 后即可用于實驗研究。

2.3 全細胞膜片鉗實驗 以P-97程序化水平拉制儀制備玻璃微電極，其尖端直徑約為1.5～2 μm。入液電阻保持在2～4 MΩ，串聯電阻補償為30%～50%。將細胞置于細胞外液中，靜置10 min，待貼壁后續以細胞外液灌流以除去殘存的KB 液。選用狀態良好、長桿狀、邊緣光滑、完整、橫紋清晰、立體感強、無收縮的細胞進行實驗。

2.4 統計分析 采用PatchMaster 軟件采集引導出的電流，用Origin7.0軟件對實驗數據進行分析并結合graphpad prism6對數據進行擬合。應用SPSS16.0軟件進行統計處理，數據以（）表示，采用配對t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 五味子乙素對大鼠心室肌細胞INa的影響 刺激方案參考文獻［13］。當膜電位保持在-80 mV，可以引導出一個內向性電流，并在短時間內達到最大值。于細胞外液中加入Nav的特異性阻滯劑河豚毒素（10 μmol／L）后該電流明顯變小，用細胞外液灌流洗脫河豚毒素，此電流又得到一定程度的恢復。由此可以確定，在此刺激方案下面所引導出的電流即為INa，見圖1A。給予五味子乙素，觀察給藥10 min 后，圖1B 顯示，與對照組比較，3、10、30、100 μmol／L 五味子乙素對INa的作用顯著增強（P＜0.05，P＜0.01），呈濃度依賴性，INa-Peak由給藥前的（-88.24 ± 6.93）pA／pF 依次降為（-77.07±6.17）、（-61.48±5.17）、（-47.78±3.69）、（-18.69±2.17）pA／pF。1、2 μmol／L 五味子乙素對INa無顯著差異，而五味子乙素在對阿霉素內化作用時，IC50為 51.50 μmol／L，100 μmol／L五味子乙素可致細胞發生凋亡［14］。因此后續實驗研究，選擇了3、10、30 μmol／L 3個濃度。

圖1 不同濃度的五味子乙素對大鼠心室肌細胞INa的影響（n=6）Fig.1 Effects of different concentrations of Sch B on INaof rats ventricular myocytes（n=6）

3.2 五味子乙素對鈉通道電流-電壓關系（I-V）曲線的影響 刺激方案參考文獻［13］。記錄給予五味子乙素前后的INa，見圖2C，并以各刺激脈沖下引導出的INa電流密度（pA／pF）對應相應測試電壓繪制出鈉通道的I-V 曲線，見圖2A。由圖2A可見，10、30 μmol／L 五味子乙素可使鈉通道的IV 曲線顯著上移，但I-V 曲線的激活電位、峰電位及形態未發生改變，3 μmol／L 五味子乙素對I-V 曲線的影響不明顯。

圖2 五味子乙素對鈉通道I-V 曲線和INa激活曲線的影響（n=6）Fig.2 Effects of Sch B on the I-V and activation curve of INa（n=6）

3.3 五味子乙素對INa激活曲線的影響 INa的激活曲線原始數據由I-V 曲線的數據轉化而來，并依Boltzmann 方程G／Gmax=1／ ｛1＋exp ［（V1／2-V）／k］｝ 進行擬合得到穩態激活曲線，見圖2B，縱坐標為電導與最大電導的比值，橫坐標為相應的測試電壓。如圖2B 所示，3、10、30 μmol／L 五味子乙素可使激活曲線發生右移，V1／2-ac由給藥前的（-53.90±5.21）mV 分別變為（-48.77±6.45）mV（P＞0.05）、（-43.69±5.34）mV、（-40.80±3.23）mV（P＜0.01），表明隨著五味子乙素濃度的增高，激活電壓相應升高，鈉通道開啟的難度也逐漸增大。

3.4 五味子乙素對INa穩態失活曲線的影響 刺激方案參考文獻［13］。給予雙脈沖刺激，分別記錄五味子乙素給藥前后INa的穩態失活電流（圖3B），并按Boltzmann 方程I／Imax=1／ ｛1 ＋exp ［（VV1／2）／k］｝ 進行擬合，繪制出INa的穩態失活曲線，見圖3A。從圖3A 可以看出，藥物可使INa的穩態失活曲線逐漸左移，表現為向超極化方向偏移。其中，3、10、30 μmol／L 五味子乙素使V1／2-in由給藥前的（-57.80 ± 6.21）mV 分別變為（-64.70±7.55）mV（P＞0.05）、（-71.16±6.45）mV、（-81.03±7.53）mV（P＜0.01），k從給藥前（5.30±0.49）分別變為（6.66±0.67）（P＞0.05）、（7.65±0.58）、（9.19±0.62）（P＜0.01）。因此，3 μmol／L五味子乙素對穩態失活動力學影響不明顯，但10、30 μmol／L 五味子乙素可明顯改變INa的穩態失活動力學特征，在穩態失活狀態下通道開放靜息電位水平發生改變，加快INa的失活。

圖3 五味子乙素對INa穩態失活曲線的影響（n=6）Fig.3 Effects of Sch B on the inactivation curve of INa（n=6）

3.5 五味子乙素對INa失活后恢復曲線的影響 刺激方案參考文獻［13］。分別記錄五味子乙素給藥前后INa的失活后恢復電流，見圖4B，并通過用One-phase association 指數方程I／Imax=1-exp（-t／τ）進行擬合，得到電流恢復曲線，縱坐標為電流與最大電流的比值，橫坐標為相對應的時間，見圖4A。由圖4A 可見，3、10、30 μmol／L 五味子乙素能使INa的失活后恢復曲線逐漸右移，恢復時間常數τ由給藥前的（16.68±1.72）ms 變為（19.69±2.55）ms（P＞0.05）、（25.73 ± 2.93）ms 和（43.79±3.87）ms（P＜0.01）。可知，3 μmol／L 五味子乙素對失活后恢復動力學影響不明顯，但10、30 μmol／L 五味子乙素可明顯改變INa的失活后恢復動力學特征，使INa從失活態向激活態轉變的時間延長。

圖4 五味子乙素對INa失活后恢復曲線的影響（n=6）Fig.4 Effects of Sch B on the curve of INarecovery from inactivation（n=6）

4 討論

離子通道的紊亂與多種疾病的發生密切相關，如常見的QT 綜合征、Brugada 綜合征、室性心動過速等，此類疾病的發生都與心肌細胞上多種離子通道有關。而心肌細胞鈉離子電流為內向電流，主要參與細胞動作電位（AP）0相去極化過程，若鈉通道發生異常，則會使心肌細胞無法產生正常的AP，導致與鈉通道相關的離子通道疾病的發生［15］。

膜片鉗技術的應用為更為有效的觀察鈉電流動力學特征提供了手段。實驗中預觀察五味子乙素對鈉電流幾種常見動力學參數的影響。激活曲線用來解釋通道開放水平的難易程度，若曲線發生右移則提示激活電壓升高，通道開放難度增大。穩態失活曲線常用來解釋通道滅活的電壓依賴性及藥物對通道滅活過程的影響，若藥物使其左移則表明藥物電壓依賴性的影響通道的滅活過程，提示該藥物可能與失活態鈉通道親和力高［16］。對于失活后恢復曲線，對其進行擬合以求得恢復時間常數，時間常數越小則恢復的越快或藥物與通道分離的快，時間常數越大則分離的越慢。

五味子已廣泛應用于臨床，現已證實對心血管系統疾病亦有療效。成分之一的五味子乙素在心血管方面的研究備受關注，然而五味子乙素對心肌細胞離子通道的研究尚少，對鈉通道的研究也是空白。因此，本研究根據有關報道的提示［17］，觀察不同濃度五味子乙素對SD 大鼠心室肌細胞INa峰值、I-V 曲線、失活和失活后恢復動力學特征的影響。結果表明，五味子乙素濃度大于3 μmol／L 能夠呈濃度依賴性地抑制INa，使I-V 曲線顯著上移，但曲線形態未發生改變，且五味子乙素在不同的膜電位水平下對INa的作用效果不同，提示五味子乙素對INa具有顯著的電壓依賴性；五味子乙素可使失活曲線顯著左移，可使恢復曲線顯著右移，進一步加強了藥物對INa的抑制作用。結合實驗結果分析，發現五味子乙素對鈉通道的激活狀態、失活狀態，恢復狀態均有作用，共同結果就是增強了五味子乙素對鈉通道的抑制作用。因此，推測現代藥理學研究證實的五味子乙素具有的對抗心臟毒性、I／R 損傷等作用可能與其抑制INa有關。

此外，臨床上已將五味子用于心肌梗死、甲狀腺機能亢進所致的心動過速治療方劑中［18］；古方將五味子配炙甘草湯附加苦參、仙鶴草、丹參、黃芪、龍牡等用于治療心動過速；五味子湯加味治療心律失常［19］等效果都十分顯著。然而這其中的作用機制還不是很明確，而本實驗結果可為解釋五味子在其中發揮作用提供部分參考價值。此外，推測心臟鈉通道功能障礙的獲得性和遺傳性疾病例如Ⅲ型長QT 綜合征，心房顫動和擴張型心肌病等，利用五味子乙素可通過糾正鈉通道功能異常從而對患者產生有益效果。

本實驗采用全細胞膜片鉗技術研究五味子乙素對心肌細胞鈉離子通道的作用，以此評估其對大鼠心臟電生理的影響。然而，對于其發揮心血管系統保護作用的具體調控機制還需要在其它通道、體內過程及病理模型等方面做更全面的探討，為其在今后開發應用提供理論依據。