呂彥霖，朱昌毫，潘耀振，陳 玲，喻 超，孫誠誼

（貴州醫科大學附院肝膽外科，貴州 貴陽550004）

近些年來，膽管癌已經成為南美和亞洲第二常見的原發性肝癌，且早期難以診斷，大多數患者診斷時已為晚期［1］。盡管隨著科技的發展，對于膽管癌的治療有了很多先進的方法，比如手術治療、放射治療和化學藥物治療等，但是在晚期患者中總體預后較差，5年生存率僅為20%～30%［2］。最近研究表明，中國傳統中藥對包括膽管癌在內的多種癌癥都有治療作用［3-4］。

青藤 堿（7，8-didehydro-4-hydroxy3，7-dimethoxy-17-methyl-9a，13a，14a-morphinan-6-one，SIN）是一種從中草藥青藤中提煉出來的活性成分，在中國已經有兩千多年用治風濕病的歷史［5］。近年來隨著對青藤堿的深入研究，發現青藤堿不僅在治療免疫相關疾病時具有抗炎［6］、鎮痛［7］、免疫抑制和抗血管生成［8］以及改善關節炎等作用，而且其抗腫瘤作用也尤為顯著。近年來，許多研究人員做了大量關于青藤堿在抗腫瘤方面的科學實驗，發現青藤堿對胃癌［9］、肝癌［10］、卵巢癌［11］以及胰腺癌［12］等多種腫瘤具有明顯的抑制作用。然而，青藤堿是否對膽管癌也具有相同的抑制作用，相關的研究目前還比較少。

本研究通過研究青藤堿對人類膽管癌細胞系HUCCT-1及TFK-1生長增殖和侵襲轉移的調節作用，探討青藤堿對膽管癌的治療作用，為開發和尋找新型抗膽管癌藥物做積極探索。

1 材料

1.1 細胞株 HuCCT-1、TFK-1膽管癌細胞株購自湖北省武漢市同濟醫院肝膽胰外科實驗室。

1.2 試藥 青藤堿（Selleck，批號S235901），胎牛血清（Gibco，批 號 1992275）、RPMI-1640（Gibco，批 號 22400105）、0.25% 胰蛋白酶（Gibco，批號25200056）、0.05%不含EDTA 的胰蛋白酶（Gibco，批號15400054），Cell Counting kit-8（CCK-8）（碧云天，批號C0037），Transwell小室（Corning，批號3422），Matrigel 膠（BD，批號354234）、AV-FITC／PI 凋亡試劑盒（Solabio，批號CA1020），RIPA 裂解緩沖液（Solabio，批號R0020），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Solabio，批號 PC0020）、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（Millipore，批 號 V900858 ），Cleaved-Caspase3（CST，批號9661S）、Cleaved-Caspase9（CST，批號9502S）、Vimentin（CST，批號5741S）、E-cadherin（CST，批號3195S）、GAPDH（CST，批號5174S），羊抗鼠（Boster Bio，批號BM2002）、羊抗兔（Boster Bio，批號BA1066）。

1.3 青藤堿溶液的配制 青藤堿首先溶于二甲基亞砜DMSO 溶液溶解，配制終濃度為50 mmol／L 的儲存液，放進4 ℃冰箱低溫避光存放。需使用時，采用無血清RPMI-1640將貯備液稀釋為10 mmol／L的工作液用以加藥處理細胞。使每組培養基中含有DMSO 的濃度為0.1%，來表明DMSO 對膽管癌細胞無毒性。

2 方法

2.1 細胞培養 2種人類膽管癌細胞株HuCCT-1、TFK-1均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，放進恒溫培養箱（37 ℃，5% CO2）中進行孵育培養，待細胞鋪滿培養瓶底部70%～80%后用胰蛋白酶進行消化后傳代處理，后續試驗選取處于對數生長期細胞。

2.2 CCK-8檢測細胞存活率 取對數生長期細胞，PBS 清洗，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%血清的培養基中和，制備細胞懸液。細胞計數后，接種4 000個細胞于96孔板每孔中，每個孔用培養基配足200 μL 體積。實驗分組分為6組，空白對照組（用不含青藤堿的1640處理）、0.125 mmol／L 青藤堿組、0.25 mmol／L 青藤堿組、0.5 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、2.0 mmol／L 青藤堿組，每組5個生物學重復，培養24 h 后按照分組進行加藥處理，處理完畢后封閉蓋子，置于細胞培養箱中培養。根據實驗分組情況，各組給予不用濃度的青藤堿處理24、48、72 h 后，分別棄去96孔板內的培養基，向每孔中加入110 μL CCK-8顯色液（10 μL CCK-8溶于100 μL 無血清培養基）。加液完畢后將96孔板置于培養箱中孵育，每隔1 h 用酶標儀測定450 nm 處的OD 值，測量3次；最后根據實驗數據，匯總分析并作圖。其公式為細胞存活率=［（空白對照組OD值-實驗組OD值）／對照組OD值］×100%。

2.3 克隆平板檢測長期細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養基中和后得到細胞懸液。細胞計數后，接種4 000個細胞于六孔板每孔中進行培養，需要反復吹打混勻，防止細胞抱團生長。待細胞貼壁后，將細胞分為4組，空白對照組（用不含青藤堿的1640處理）、0.5 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、2.0 mmol／L 青藤堿組，每組6個生物學重復，進行加藥處理。各孔中青藤堿和RPMI-1640培養基總體積配足3.5 mL，放入無菌細胞培養箱繼續培養。培養10～14 d 后終止培養，用PBS 漂洗細胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結晶紫染色30 min，最后使用PBS 清洗數遍后放入烘箱，烘干進行拍照處理并統計分析克隆形成數量。

2.4 Annexin V／PI 雙染色檢測細胞凋亡率 取對數期生長膽管癌細胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養基中和后得到細胞懸液。顯微鏡下計數后按每孔接種5 ×104個膽管癌細胞均勻接種于六孔板中。后放入培養箱中培養，待細胞貼壁后，細胞分組同“2.3”項下。按照分組加入不同濃度的青藤堿，繼續培養24 h 后，收集各組細胞。將六孔板內各孔上清液收集于15 mL 離心管，PBS 清洗后收集于15 mL 離心管內，再使用1.0 mL 不含EDTA 的胰蛋白酶消化細胞，2.0 mL含血清培養基中和后收集于15 mL 離心管，后再用PBS 清洗一遍六孔板，各收集于相應15 mL 離心管內，設置離心機1 200 r／min，離心5 min，棄上清。后加入3 mL PBS 于15 mL 離心管，轉移細胞懸液于流式管內，繼續離心，1 200 r／min，離心5 min，以清洗細胞。棄上清后，每管加入500 μL 1×Binding buffer、懸浮細胞數目為1 ×106／mL，再加入5 μL 的AnnexinV FITC 染液和10 μL PI 染色液，輕輕吹打均勻后，4 ℃避光孵育15 min，流式細胞儀上機檢測，分析記錄結果。

2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數期生長膽管癌細胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養基中和后得到細胞懸液。顯微鏡下計數后按每孔接種2×106個膽管癌細胞均勻接種于六孔板中。后放入培養箱中培養，待細胞貼壁后，將細胞分為4組，分組情況同“2.3”項下，每組設置5個生物學重復。使用200 μL 無菌槍頭在六孔板底部細胞層上劃痕，力度和角度一致，使各條劃痕粗細均勻。后用PBS 清洗兩次將劃痕脫落的細胞清洗干凈，加入不含血清的RPMI 1640培養基后，使用倒置相差顯微鏡觀察劃痕的寬度并拍照，計算并記錄0 h 劃痕面積。后按照分組按照各組所設濃度加入青藤堿。放入培養箱進行培養24 h后，再次使用倒置相差顯微鏡拍照并計算劃痕面積，最后根據實驗數據計算細胞遷移率（%）。細胞遷移率=［（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）／0 h劃痕面積］×100%。

2.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將Matrigel與RPMI-1640培養基按照1 ∶5的比例稀釋后，取50 μL 均勻地涂覆到Transwell 上室的底部，將Transwell 小室放入24孔板中，室溫通風過夜使之形成凝膠狀。取對數期生長膽管癌細胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用無血清培養基中和后得到細胞懸液。顯微鏡下計數后按每孔接種2×104個膽管癌細胞均勻接種于上室中，使用無血清培養基配足200 μL 體積。下室加入660 μL 含10%FBS 的1640培養基后，放入培養箱進行培養。待細胞貼壁后進行分組，將細胞分為4組，分組情況同“2.3”項下，每組設置3個生物學副孔，按照分組情況進行加藥處理，后繼續放入培養箱進行培養。培養24 h后終止培養，用PBS 漂洗細胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結晶紫染色30 min，最后使用PBS 清洗數遍后放入烘箱，烘干進行拍照處理并計算穿膜細胞數。

2.7 Western blot 檢測凋亡及侵襲相關蛋白表達取對數期生長膽管癌細胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用含10%血清的培養基中和后得到細胞懸液。顯微鏡計數后接種5×105個細胞于六孔板每孔內，放入培養箱進行培養。待細胞貼壁后，對細胞進行分組，分組情況同“2.3”項下，按照分組對細胞進行加藥處理。藥物處理24 h 后，收集細胞干粉。使用RIPA 裂解液在4 ℃環境下提取細胞總蛋白，使用BCA 蛋白測定濃度試劑盒測定蛋白濃度，按照蛋白上清液：5×Loading Buffer=4 ∶1的比例加入5×loading buffer，95 ℃煮10 min。取每孔泳道20 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，90 V，2 h。后恒流300 mA 電轉2 h 轉至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 9、E-cadherin、Vimentin 等一抗于4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜3次15 min／次。加入二抗室溫孵育2 h，TBST 再洗膜3次，15 min／次，最后使用ECL 發光液曝光顯色，灰度值分析使用ImageJ 1.45 s 軟件。

2.8 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析處理。實驗數據以（）表示，多組間比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

3 結果

3.1 青藤堿抑制膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1增殖 CCK-8實驗結果顯示，人類膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1經過青藤堿處理后，2種膽管癌細胞生存率均明顯降低，且隨著藥物濃度增大以及藥物作用時間的延長，抑制作用逐漸加強，呈劑量和時間依賴性。除青藤堿0.125 mmol／L，24 h 這組外，與空白對照組比較，青藤堿能顯著抑制HuCCT-1、TFK-1細胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。此外，克隆平板表明青藤堿對于膽管癌細胞的長期增殖具有明顯抑制作用，且抑制效果與藥物濃度呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。表明青藤堿可以抑制膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1增殖。

圖1 不同濃度的青藤堿對膽管癌細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of sinomenine on celluar viability of cholangiocarcinoma

圖2 不同濃度的青藤堿對膽管癌細胞長期增殖能力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sinomenine on long-term cellular proliferation of cholangiocarcinoma

3.2 青藤堿促進膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1凋亡 流式細胞數表明，隨著青藤堿藥物濃度的提升，膽管癌細胞凋亡率明顯增加，且呈劑量依賴性（P＜0.01），見圖3～4。與空白對照組比較，青藤堿顯著促進凋亡關鍵蛋白 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達，且呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），見圖5～6。表明青藤堿可以促進膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1凋亡。

圖3 不同濃度青藤堿對HuCCT-1細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of different concentrations of sinomenine on apoptosis of HuCCT-1 cells

圖4 不同濃度青藤堿對TFK-1細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of different concentrations of sinomenine on apoptosis of TFK-1 cells

圖5 不同濃度青藤堿對HuCCT-1 Cleaved caspase 3、Cleaved casepase 9蛋白表達的影響Fig.5 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 proteins in HuCCT-1 cells

圖6 不同濃度青藤堿對TFK-1 Cleaved caspase 3、Cleaved casepase 9蛋白表達的影響Fig.6 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 proteins in TFK-1 cells

3.3 青藤堿抑制膽管癌細胞系HuCCT-1、TFK-1侵襲遷移 Transwell 實驗結果表明，隨著青藤堿濃度的遞增，膽管癌細胞穿過鋪有Matrigel 膠小室的細胞數目也相應減少，膽管癌細胞的侵襲率逐漸下降，且結果呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖7。劃痕實驗結果表明，與空白對照組比較，青藤堿組劃痕寬度增寬，細胞遷移率顯著下降，細胞遷移能力越來越慢，呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖8。此外，上皮-間葉轉化（EMT）為惡性腫瘤浸潤的機制，E-cadherin、vimentin 為上皮間質轉化標記物的表達，與空白對照組比較，青藤堿以劑量依賴的方式顯著升高E-cadherin、且降低vimentin 蛋白表達（P＜0.05），見圖9～10。

圖7 不同濃度青藤堿對膽管癌侵襲能力的影響Fig.7 Effects of different concentrations of sinomenine on invasion ability of cholangiocarcinoma

圖8 不同濃度的青藤堿對膽管癌細胞遷移能力的影響Fig.8 Effects of sinomenine on invasion of cholangiocarcinoma

圖9 不同濃度青藤堿對HuCCT-1 Vimentin、E-Cadherin 蛋白表達的影響Fig.9 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of Vimentin and E-Cadherin proteins in HuCCT-1 cells

圖10 不同濃度青藤堿對TFK-1 Vimentin、E-Cadherin 蛋白表達的影響Fig.10 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of Vimentin and E-Cadherin proteins in TFK-1 cells

4 討論

膽管癌早期診斷困難，是以高發病率和高死亡率為特征的肝膽腫瘤。目前針對膽管癌的治療取得了很大進展，但是患者的5年生存率依舊很低［13］。現臨床上應用的許多抗腫瘤藥物不僅價格昂貴且不良反應較多［14］。因此，尋找一種新的、廉價的、不良反應較小的抗腫瘤藥物，從而提高患者的生活質量是非常必要且緊要的。據報道，青藤堿可以在體內體外發揮良好的抗腫瘤作用，且不良反應較小［15］。本次實驗，研究了青藤堿作用于膽管癌之后產生的抗腫瘤作用。

本實驗以人類膽管癌細胞為研究對象，采用一系列體外實驗研究青藤堿對膽管癌的抗腫瘤作用。CCK-8與克隆平板實驗表明，青藤堿對膽管癌細胞的存活及增殖能力有明顯的抑制作用，且成時間和劑量依賴性。Annexin V／PI 雙染色法結果發現，青藤堿可以促進膽管癌細胞凋亡，且該凋亡作用呈劑量依賴性。Transwell 侵襲實驗結果表明，膽管癌細胞的侵襲能力隨著青藤堿濃度的升高逐漸降低。劃痕實驗結果表明，兩株膽管癌細胞在相同的時間內的遷移距離明顯受到青藤堿濃度的影響，2 mmol／L 濃度的青藤堿基本上使膽管癌細胞喪失遷移能力。

細胞凋亡，即細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡在消除突變和惡性腫瘤細胞中發揮著重要作用［16］。已知多種中藥可以通過誘導腫瘤細胞凋亡來達到抑制腫瘤生長的目的［17-19］。Annexin V／PI雙染色法表明，青藤堿以劑量依賴性地促進膽管癌細胞凋亡。caspases 家族可以調節多種生物過程，包括細胞凋亡、分化、炎癥等。其中caspase-3、caspase-9又歸為促凋亡caspases。caspase-3如今視為細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，而caspase-9被歸類為凋亡效應者。活化的caspase-9（cleaved-caspase-9）可以進一步激活caspase-3，而活化的casepase-3（cleaved-caspase-3）的作用主要是催化多聚（ADP-核糖）聚合酶裂解，該酶與DNA 修復和基因完整性監護有關，從而誘導細胞凋亡的發生［20-21］。本實驗結果表明，青藤堿可能通過促進膽管癌細胞凋亡以達到其抗腫瘤作用。

腫瘤轉移全身往往是導致腫瘤患者死亡的主要原因。眾所周知，EMT 在腫瘤轉移方面起著決定性的作用，是腫瘤細胞侵襲和遷移的主要因素［22］。當細胞發生EMT 時，上皮標志物，如E-cadherin表達量下降；而間質標志物，如波形蛋白vimentin表達量上升［23］。本實驗結果表明，青藤堿可能通過逆轉膽管癌細胞EMT 來達到抑制膽管癌細胞侵襲和遷移的目的。

總而言之，青藤堿可以升高cleaved caspase 3、cleaved caspase 9和E-cadherin 以及降低vimentin 蛋白的表達水平，有效地抑制膽管癌細胞增殖，侵襲遷移并促進凋亡。研究表明青藤堿對膽管癌具有明顯的抗腫瘤作用，可能為膽管癌的臨床治療提供新的視角。但是若要實現青藤堿的臨床用藥，還需更多的臨床試驗對青藤堿做出進一步研究。