王建筑，畢研平，李 菲，陳 瑩

［山東第一醫科大學（山東省醫學科學院） 藥學院，山東 泰安271016］

柚皮素是二氫黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗癌、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性［1-6］，但該成分脂溶性和水溶性均較差，并且在家兔體內的生物利用度以游離柚皮素計算僅為4%［7］，體內吸收差、生物利用度低等因素使其臨床應用受到一定限制［8］。納米給藥系統因其微小的粒徑和特殊的結構而具有一系列獨特優勢，可通過不同載體來顯著增加難溶性藥物溶解性，并提高其口服生物利用度，此外還能明顯改善釋藥特性。目前，改善柚皮素溶解度、生物利用度的方法主要有固體脂質納米粒［9-10］、膠束［11］、納米乳［12］等。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是一類可降解的共聚物，安全性高，生物相容性良好［13-14］，孫雅楠［15］等采用納米沉淀法結合脂質體擠壓法成功制備了紅細胞膜包裹PLGA 納米粒，發現它具有明顯的殼-核結構，可使藥物具有緩釋作用，而且體外毒性顯著降低。目前，制備PLGA 納米粒時需要加入適量穩定劑以防止自我聚集，常用的有聚維酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）等，但這些穩定劑難以徹底清除，而且對人體具有一定毒性。牛血清白蛋白是由疏水性氨基酸殘基和親水性氨基酸殘基構成，作為藥物載體具有安全無毒、無免疫原性、生物相容性好等優點，在體內具有天然獨特的靶向性和緩釋性。在采用乳化溶劑揮發法制備PLGA 納米粒過程中，白蛋白可利用自身多個疏水性結合部位與疏水PLGA 的結合，從而起到“表面活性劑”的作用，同時在納米粒的表面利用二硫鍵作用形成交聯結構，包裹在納米粒的表面而形成一層蛋白層［16］，此外還可選擇其作為穩定劑增加納米粒穩定性。

本實驗將制備載柚皮素的牛血清白蛋白修飾PLGA 納米粒，既可增加藥物溶解性，又能利用微球緩釋性來解決藥效短、頻繁給藥的問題，并對該納米粒進行結構表征以確認其結構，最后探究其體外釋藥行為，為柚皮素臨床應用奠定基礎。

1 材料

柚皮素（含有量98%，陜西慧科植物開發有限公司）。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（50 ∶50，分子量30 000 Da，濟南岱罡生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（合肥博美生物科技有限責任公司）。PC-2006高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；激光粒度分析儀（英國Malvern 公司）；IR Affinity-15傅立葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；JY92-2D 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超濾管（0.5 mL，3 kD，美國Millipore 公司）；透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da）。

2 方法

2.1 納米粒制備 采用乳化溶劑揮發法制備。精密稱取4 mg 柚皮素和適量PLGA，溶于2 mL氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，在攪拌下將其緩慢滴加到8 mL 20 mg／mL 牛血清白蛋白溶液中，冰水浴探頭超聲（600 W）4 min 乳化分散，形成O／W 型納米乳，室溫下置于電磁攪拌器上繼續攪拌4 h，得到帶有藍色乳光半透明的膠體溶液，再將其置于超速冷凍離心機內離心（18 000×g）30 min，去離子水重新分散后冷凍干燥，即得。

2.2 包封率、載藥量測定

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 磷酸-乙腈（55 ∶45）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長288 nm；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2 方法學考察 精密稱取柚皮素適量，流動相配制成2、4、8、16、32、64 μg／mL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以峰面積（Y）對溶液質量濃度（X）進行線性回歸，并測定其精密度和加樣回收率。

2.2.3 測定方法 取納米粒6 mg，加入2 mL 純水復溶，取0.4 mL 置于超濾管中，3 000×g離心10 min，取100 μL 超濾液加900 μL 甲醇適當稀釋，HPLC 法測定未被PLGA 包封的藥量。另取復溶后PLGA 納米粒混懸液100 μL，加900 μL 乙腈溶解破壞納米粒渦 旋 30 s，超 聲 5 min，15 000 r／min高速冷凍離心10 min 沉淀蛋白，取上清液，HPLC 法測定柚皮素總藥量。取適量混懸液進行冷凍干燥，稱定凍干品質量，按下式計算包封率、載藥量。

包封率=［（m總-m包）／m總］×100%，載藥量=［（m總-m包）／m］×100%。其中，m包為納米粒中包裹藥物量，m總為總藥量，m為納米粒總質量。

2.2.4 粒徑、PDI 測定及形態觀察 將復溶后的納米粒用純水適當稀釋后，馬爾文激光粒度分析儀測定其粒徑和PDI。再取適量滴在銅網上，純水清洗，自然晾干后2%磷鉬酸鈉溶液負染，晾干后置于透射電鏡（TEM）下觀察納米粒形態大小，并進行拍照。

2.2.5 穩定性考察 納米粒凍干樣品中加入純水和磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）復溶，并稀釋至制備時的濃度，冰箱冷藏室（4 ℃）中放置14 d，觀察其粒徑、PDI、包封率變化。

2.2.6 體外釋放行為 取納米粒凍干粉加純水復溶、柚皮素乙醇溶液各約2 mL（均含柚皮素約1 mg）加到處理好的透析袋中，兩端扎緊，將其完全浸沒到37 ℃100 mL 體外釋放液［含0.5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）］中攪拌（100 r／min），于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 h 各取樣1 mL，并補充新鮮釋放介質，微孔濾膜過濾，HPLC 法測定柚皮素含有量，計算累積釋放度。

3 結果

3.1 方法學考察 柚皮素回歸方程為Y=48.39X＋2.38（r=0.999 3），在2～64 μg／mL 范圍內呈良好的線性關系，而且該方法精密度（RSD＜3%）和平均加樣回收率（97%～103%，RSD＜5%）均符合相關要求。

3.2 制備工藝優化

3.2.1 超聲功率 選擇15 mg／mL 牛血清白蛋白溶液8 mL 作為水相，25 mg PLGA（50 ∶50）溶于2 mL 氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲時間4 min，考察超聲功率400、500、600、700 W，結果見表1。由表可知，隨著超聲功率增加粒徑、PDI 呈減小趨勢，但變化不明顯，故選擇600 W 作為超聲功率。

3.2.2 超聲時間 選擇“3.2.1”項下水相和油相，超聲功率600 W，考察超聲時間3、4、5、6 min，結果見表2。由表可知，超聲時間4 min 后粒徑、PDI 基本穩定，故選擇4 min 作為超聲時間。

表1 超聲功率對粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.1 Effects of ultrasonic power on particle size and PDI（n=3）

表2 超聲時間對粒徑、PDI 的影響（n=3）Tab.2 Effects of ultrasonic time on particle size and PDI（n=3）

3.2.3 牛血清白蛋白質量濃度 選擇“3.2.1”項下油相，水相體積8 mL，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察牛血清白蛋白質量濃度10、15、20、25 mg／mL，結果見表3。由表可知，牛血清白蛋白質量濃度對粒徑、包封率影響較大，可能是由于它作為表面活性劑，在油水兩相乳化時會影響納米乳形成，從而影響納米粒質量，故選擇20 mg／mL 作為牛血清白蛋白質量濃度。

表3 牛血清白蛋白質量濃度對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.3 Effects of bovine serum albumin concentration on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.2.4 PLGA 質量濃度 選擇“3.2.1”項下水相，PLGA 溶于溶于氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察PLGA質量濃度50、25、12.5、6.25 mg／mL，結果見表4。由表可知，低質量濃度（6.25 mg／mL）時粒徑、包封率明顯小于其他質量濃度；高質量濃度（25、50 mg／mL）時粒徑明顯大于中質量濃度（12.5 mg／mL），但包封率無明顯變化，故選擇12.5 mg／mL 作為PLGA 質量濃度。

3.2.5 油水相比例 選擇20 mg／mL 牛血清白蛋白溶液作為水相，PLGA（50 ∶50）溶于2 mL 氯仿／乙醇（4 ∶1）中作為油相，超聲功率600 W，超聲時間3 min，考察油水相比例2 ∶5、2 ∶8、2 ∶11、2 ∶14，結果見表5。由表可知，當油水相比例超過2 ∶8時，粒徑明顯變小，而包封率在該比例時最高，故選擇2 ∶8作為油水相比例。

表4 PLGA 質量濃度對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.4 Effects of PLGA concentration on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

表5 油水相比例對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.5 Effects of oil-water phase ratio on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.2.6 投藥量 選擇選擇“3.2.1”項下水相和油相，油水相比例8 ∶2，超聲功率600 W，超聲時間4 min，考察投藥量4、5、6、7 mg，結果見表6。由表可知，投藥量4、5 mg 時，粒徑小而均勻，包封率高；6 mg 時，包封率明顯下降；7 mg時，納米粒出現明顯的渾濁，離心后通過偏光顯微鏡發現它是由藥物結晶造成的，故選擇5 mg 作為投藥量。

表6 投藥量對粒徑、PDI、包封率、載藥量的影響（n=3）Tab.6 Effects of drug-fed consumption on particle size，PDI，encapsulation efficiency and drug loading（n=3）

3.3 粒徑、形態 納米粒粒徑為（98.3±2.34）nm，PDI 為（0.149±0.012）。圖1顯示，納米粒呈球形，具有明顯的核-殼結構，形態規整，大小均勻，之間無粘連，粒徑約為100 nm 左右。

3.4 穩定性 表7顯示，無論是在純水還是在磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）中，納米粒粒徑、包封率均未發生明顯變化，表明其穩定性良好。

圖1 納米粒TEM 圖Fig.1 TEM images for nanoparticles

表7 納米粒穩定性考察結果Tab.7 Results of stability investigation of nanoparticles

3.5 體外釋放行為 圖2顯示，原料藥能順利通過透析袋，在6 h 時已釋放完全；納米粒釋藥初期附著于其表面的藥物快速釋放，形成輕微突釋效應，而后期釋藥平緩，在24 h 時累積釋放度約為80%，呈現出明顯的緩釋效應。

圖2 樣品體外釋藥曲線Fig.2 In vitro drug release curves for samples

3.6 紅外測定 將柚皮素、牛血清白蛋白、PLGA、納米粒分別與溴化鉀混合研磨后，通過紅外可見分光光度計測定，結果見圖3。由圖可知，納米粒在～1 300 cm-1處鈍而弱的峰可能為N-H，～1 600 cm-1處銳而強的峰可能為C=O，1 500～1 400 cm-1處吸收強度比較小的尖峰可能為C=N；牛血清白蛋白吸收峰和納米粒基本相似；PLGA 在～2 900 cm-1處2個尖峰可能是乳酸中C-H，～1 700 cm-1處1個強峰可能為C=O，～1 400 cm-1處尖峰可能為-OH；柚皮素雜峰比較多，在1 629 cm-1處出現明顯尖峰，吸收強度較強，可能為苯環特征峰，～1 600 cm-1處最強尖峰為C=O，～1 100 cm-1處1個吸收峰初步判斷為C-O-C，3 200～3 000 cm-1處扁平峰為羥基。另外，通過峰形可觀察到納米粒與牛血清白蛋白的峰比較接近，表明在前者外層吸附著1層白蛋白。

圖3 樣品紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra for samples

4 討論及結論

乳化溶劑揮發法可分為兩步，探頭超聲乳化制備初乳，以及攪拌下揮發有機溶劑，水油兩相超聲后形成納米乳，由于溶劑揮發后納米粒逐漸形成，故超聲乳化過程對納米粒形成及粒徑、包封率的影響很大。超聲過程中不斷增加功率、延長時間并不能明顯減少納米粒粒徑，其原因可能是達到一定功率和時間后會降低油水兩相的表面張力，并使之達到平衡，形成納米乳，故不需無限制增加兩者。

牛血清白蛋白質量濃度為10、15 mg／mL 時，樣品均在1 d 后出現沉淀，表明質量濃度過低不能起到穩定納米粒膠體體系的作用；質量濃度足夠，蛋白充分包圍在納米粒表面，使其均勻分散在懸浮液中；質量濃度過高，會導致納米乳體系黏度過大，影響超聲乳化效果。因此，確定牛血清白蛋白質量濃度為20 mg／mL。

當水相體積為5 mL 時，納米混懸液于48 h 后出現沉淀，表明水相體積不能過小，其原因可能為油水相混合后超聲時可形成水包油（O／W）乳劑，若水相體積減小，有機相形成的微小乳滴就不能較好地分散在水相中，而且水相減少可導致乳滴之間融合趨勢增加，溶劑揮去后納米粒容易形成沉淀。

白蛋白載藥體系在延長載體體內循環時間、提高藥物穩定性和藥效等方面具有其他傳統藥物載體不可比擬的優勢，相較單純白蛋白載藥，白蛋白-PLGA 納米粒復合型載藥體系可實現更多功能，如體內腫瘤靶向性等。本實驗制備了載柚皮素的牛血清白蛋白修飾PLGA 納米粒，并初步探究其優化工藝、結構表征、體外釋放等，可為后期進一步體內研究奠定基礎。