腫瘤易化小鼠術后認知功能障礙的發生

吳 彤 汪曉強 張芮芮 蘇殿三 俞衛鋒 田 婕

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種常見的麻醉手術相關的并發癥，可發生于14%～24%的非心臟手術患者，其特點是患者手術后認知學習行為能力受損，對外界信息的處理能力降低［1-2］，可嚴重影響患者的術后生活質量，甚至發展為不可逆的認知障礙［3］。關于POCD的發病機制尚不完全清楚，目前最為廣泛接受的假說是中樞炎性反應是POCD的關鍵致病原因［4-6］。目前，全球由腫瘤所致的負擔逐年加重，隨著臨床診斷技術的發展、外科手術技術的進步和治療手段的不斷革新，約80%的腫瘤患者需要手術干預［7-8］。隨著人口老齡化的發展，腫瘤患者的術后精神健康狀態不僅是一個重要的臨床議題，毫無疑問也將成為一個不可忽視的社會問題［9-10］。值得注意的是，腫瘤與炎性反應的關系十分復雜。一方面，慢性炎性反應在腫瘤的發生中扮演著重要角色，至少25%的腫瘤發生與慢性炎性反應相關［11-12］；另一方面，各種各樣的炎性細胞，包括先天性免疫和獲得性免疫細胞，都可以被腫瘤細胞激活［13-14］。在機體識別到腫瘤細胞的存在時，絕大多數炎性細胞都會擴增、分泌炎性細胞因子或在腫瘤微環境中與其他細胞產生交互作用而影響腫瘤的進程［13-16］。由激活免疫系統引起的神經炎癥的瀑布反應是認知損傷的關鍵因素，因此推測擁有特殊炎癥環境的荷瘤個體在受到手術應激時會表現出與正常個體不同的免疫防御特點和神經炎癥應答，因而其術后認知功能與正常個體可能也有所不同。本研究通過結合小鼠皮下荷瘤模型與骨科手術，探討荷瘤狀態對小鼠術后認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的構建和分組 本研究的倫理審查證明由上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物飼養管理中心提供（RJ-2017-10-10）。2月齡雄性C57BL／6J小鼠由上海交通大學醫學院實驗動物研究中心提供，體重23～25 g。將小鼠飼養于標準化籠盒內自由飲食，維持溫度為（22±2）℃，環境為每12 h日夜交替。小鼠適應新的環境至少長于實驗開始前的7 d。根據荷瘤和手術情況，將小鼠隨機分入對照組、手術組、腫瘤組和腫瘤加手術組。

1.2 腫瘤接種模型建立 腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠于右背側腋窩皮下組織內接種小鼠來源的結腸癌細胞系 MC38細胞懸液（100μL），接種細胞數量為2×105／只。隨后，小鼠被放回各自的籠盒中，接種后第7天起，每2～3 d檢查一次小鼠的基本狀況。3周后，待腫瘤長徑為0.8～1.0 cm，行脛骨骨折內固定手術。

1.3 脛骨骨折內固定術 手術組和腫瘤加手術組小鼠在氟哌利多（200μg／kg）和芬太尼（10 mg／kg）復合麻醉下行脛骨骨折內固定手術。切皮前于皮下注射布托啡諾（0.4 mg／kg）鎮痛。左后側脛前皮膚備皮、消毒、鋪巾，于左后側脛前皮膚沿中線做一長約1 cm的縱形切口，分離并暴露小鼠脛骨，分離骨膜。將一根長約8 mm、直徑0.38 mm的針置入骨髓腔內，切斷脛骨。術畢，用0.9%氯化鈉溶液清理傷口，縫合切口，將小鼠放回干凈的籠盒內，保溫，等待麻醉蘇醒。

1.4 Morris水迷宮實驗 每組取7或8只小鼠，采用用Morris水迷宮實驗檢測各組小鼠的參考記憶（reference memory）。在水迷宮開始前，每天撫觸小鼠約2 min，持續3 d，讓小鼠熟悉實驗者的氣味，以減少應激反應。在脛骨骨折手術后第3天開始水迷宮實驗，實驗持續5 d，分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗歷時4 d，每天訓練4次，每輪間隔30～40 min，將平臺置于第2象限（靶象限）中間位置，距水面1～2 cm，訓練過程中平臺位置保持不變，每天隨機選取除靶象限外的其他3個象限的任意4個定點投放小鼠。小鼠入水后可自由尋找平臺，若在1 min內成功找到平臺，該輪訓練終止，并使小鼠在平臺上停留20 s；若小鼠不能在1 min內成功找到平臺，可將其輕輕引導至平臺并使其在平臺上停留20 s，記錄小鼠游泳的軌跡、運動速度和找到水下平臺所用時間（逃避潛伏期）。水迷宮實驗第5天，進行空間探索實驗檢測小鼠對空間位置的記憶能力。撤掉平臺，分別在目標象限和相反象限入水點將小鼠投入池內，記錄小鼠60 s內各象限時間分布和游泳速度等參數，兩次實驗結果取平均值。具體方法參照參考文獻［17］。

1.5 Western印跡法檢測小鼠海馬組織內可溶性淀粉樣前體蛋白（s APP）α和IL-6蛋白質表達分別于脛骨骨折內固定術后第7天和術后48 h處死小鼠并分離其海馬組織，提取蛋白質，檢測s APPα和IL-6蛋白質表達。采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量（美國Thermo Fisher公司）法定量蛋白質濃度，以總蛋白質量25μg／孔進行8%SDS-PAGE變性電泳。電泳結束后，將凝膠上的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。以3%胎牛血清白蛋白（BSA）于室溫封閉1 h。所用一抗分別為小鼠抗小鼠s APPα抗體（1∶1 000，德國IBL公司），兔抗小鼠IL-6抗體（1∶1 000，美國CST公司），二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（比例均為1∶1 000，上海碧云天生物技術有限公司），以β-actin為內參照。顯色條帶后，應用Image Lab圖像分析軟件分析處理條帶。

1.6 RT-PCR檢測小鼠海馬組織內IL-6 mRNA表達 每組另取8只小鼠，術后48 h取1葉海馬組織放入TRIzol（美國Sigma公司）中提取RNA。然后將RNA樣本溶解于DEPC溶液中，應用Nano drop分光光度計檢測提取的mRNA濃度。應用反轉錄試劑盒（日本Ta KaRa公司）將m RNA轉化為cDNA，將熒光染料SYBR Green與cDNA配成10μL反應體系，進行RT-PCR擴增。IL-6上游引物為5’-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC-3’，下 游 引 物 為 5’-TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3’；GAPDH 上游引物為5’-AAG AAG GTG GTG AAG CAG GCA TC-3’，下游引物為5’-CGG CAT CGA AGG TGG AAG AGT G-3’。

1.7 ELISA檢測小鼠外周血血漿中IL-6含量每組另取的8只小鼠術后48 h取海馬組織的同時取其外周血。離心分離血漿后，參照IL-6 ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）說明書進行操作。所有步驟完成后，應用酶標儀檢測波長為450和570 nm吸光度A值，用A570值矯正檢測結果。根據標準曲線計算各樣本IL-6含量。

1.8 統計學處理 應用Prism 7統計學軟件。呈正態分布的計量資料以x-±s表示，采用連續測量的方差分析比較小鼠Morris水迷宮平均游泳速度和小鼠逃避潛伏期隨訓練天數的變化情況；采用單因素方差分析比較各組小鼠測試階段的穿越平臺次數、目標象限游泳時間、海馬組織中IL-6和s APPα蛋白質表達水平、IL-6 m RNA表達水平，以及血漿IL-6含量。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 MC38腫瘤細胞接種2周后，小鼠皮下可觸及瘤體組織。再1周后，腫瘤長徑達到0.8～1.0 cm，對小鼠左后肢行脛骨骨折內固定術。與對照組小鼠相比，腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠進食飲水和自主行為無明顯異常，皮毛有光澤。

2.2 Morris水迷宮實驗結果 各組小鼠間游泳速度的差異無統計學意義（P值均＞0.05）；水迷宮實驗第3和4天定位航行實驗階段，腫瘤加手術組小鼠的逃避潛伏期顯著長于對照組同時間（P值分別＜0.05、0.01），而手術組和腫瘤組與對照組間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05），見表1。水迷宮實驗第5天空間探索實驗階段，撤掉水下平臺后，腫瘤加手術組小鼠在目標象限游泳時間顯著短于對照組（P＜0.05），穿越平臺所在位置的次數顯著少于對照組（P＜0.01），而手術組和腫瘤組與對照組間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05），見表2。

2.3 術后小鼠海馬組織內s APPα表達 對照組、手術組、腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠海馬組織內sAPPα的相對蛋白質含量分別為0.28±0.05、0.23±0.05、0.24±0.09、0.16±0.03，腫瘤加手術組顯著低于對照組（P＜0.05），而手術組和腫瘤組與對照組間的差異均無統計學意義（P值均＜0.05），見圖1。（x-±s）

表1 4組小鼠Morris水迷宮游泳速度和逃避潛伏期比較

表2 4組小鼠空間探索實驗目標象限游泳時間和穿越平臺所在位置次數比較（x-±s）

圖1 Western印跡法檢測各組小鼠海馬組織內s APPα蛋白質的表達

2.4 術后小鼠海馬組織內IL-6蛋白質和IL-6 mRNA表達 對照組、手術組、腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠海馬組織內IL-6蛋白質相對表達量分別為1.04±0.12、1.35±0.21、1.17±0.17、1.94±0.62，腫瘤加手術組顯著高于對照組（P＜0.01），而手術組和腫瘤組與對照組間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05），見圖2。對照組、手術組、腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠海馬組織內IL-6 m RNA相對表達量分別為1.07±0.41、1.25±0.31、1.25±0.33、1.12±0.43，各組間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

圖2 Western印跡法檢測各組小鼠海馬組織內IL-6蛋白質表達

2.5 術后小鼠外周血血漿內IL-6水平 術后48 h對照組、手術組、腫瘤組和腫瘤加手術組小鼠血漿IL-6水平分別為（0.97±0.26）、（3.47±1.27）、（4.56±2.34）、（9.16±6.65）ng／L，腫瘤加手術組顯著高于對照組（P＜0.05），而手術組和腫瘤組與對照組間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

3 討 論

本研究通過建立成年小鼠皮下荷瘤和脛骨骨折內固定手術模型，檢測荷瘤狀態對小鼠POCD的影響。本研究發現，脛骨骨折內固定手術不影響普通成年小鼠術后空間參考記憶，但會引起成年荷瘤小鼠該種記憶的損傷，伴隨腦內神經營養分子s APPα表達降低，以及術后48 h外周血血漿和海馬組織中促炎細胞因子IL-6表達水平升高，但是海馬組織中IL-6 mRNA相對表達量無明顯變化。大量文獻提示，中樞高水平IL-6與機體學習記憶能力降低密切相關，本研究結果提示，荷瘤小鼠更容易發生POCD可能與其手術后海馬組織中高表達IL-6有關，而IL-6更可能來源于外周而非中樞本身。

本研究應用Morris水迷宮檢測小鼠能否對水下平臺的空間位置形成準確記憶。在定位航行實驗階段，各組小鼠的逃避潛伏期隨訓練天數的增加逐漸縮短，表明各組小鼠逐漸對水下平臺位置形成記憶。空間探索實驗結果提示，腫瘤加手術組小鼠在目標象限的平均游泳時間顯著短于對照組，穿過原水下平臺位置的次數顯著少于對照組，表明該組小鼠的記憶能力顯著低于對照組小鼠。這一現象未在手術組小鼠中出現，提示與普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易在術后出現認知功能損傷。空間參考記憶代表了小鼠對水下平臺的長時記憶能力，其管理中樞主要位于海馬組織，因此之后本研究檢測了海馬組織中s APPα表達。s APPα是淀粉樣前體蛋白（APP）在內切酶的作用下生成的子片段，與同樣是在APP剪切后形成的Aβ不同，s APPα具有較為公認的神經營養和保護作用，可增加突觸密度，促進已有的記憶鞏固，防止毒性物質對神經突觸的損傷［18-19］。本研究結果顯示，術后荷瘤小鼠海馬組織內s APPα的相對蛋白質含量顯著低于對照組，證明手術可引起荷瘤小鼠海馬組織內具有神經保護作用的分子表達降低，使得腫瘤加手術組小鼠自身的神經保護作用低于一般小鼠。

既往研究［4-5，20］結果提示，外周手術可引起成年個體發生一過性中樞炎性反應。術后12 h海馬區IL-6水平升至峰值［4，21］，術后48 h降至基礎水平［22］，這種一過性中樞炎性反應不會損傷成年小鼠的空間參考記憶［20］。本研究結果也顯示，普通成年小鼠海馬組織內IL-6蛋白質相對表達量在術后48 h基本回歸基礎水平，而荷瘤小鼠海馬組織內的IL-6表達仍保持在較高水平。由于廣泛而長時的中樞炎性細胞因子暴露是導致認知紊亂的關鍵因素［21-23］，因而術后荷瘤小鼠海馬組織內的IL-6持續高表達為荷瘤小鼠更容易發生POCD提供了合理的解釋。有趣的是，在MC38腫瘤模型中，荷瘤小鼠術后48 h海馬組織內IL-6 mRNA相對表達量在各組間的差異無統計學意義，且在血漿中IL-6水平的升高趨勢與海馬組織中IL-6蛋白質相對表達量的升高趨勢保持一致，據此推測，術后48 h荷瘤小鼠海馬組織內升高的IL-6更可能來源于外周循環中活化的炎性細胞，而不是海馬組織本身。荷瘤小鼠手術后外周循環中炎性細胞因子長時間高表達的原因尚不清楚，推測可能與荷瘤個體中的腫瘤相關免疫細胞在手術后活化有關，尚需要更多的研究加以證實。

本研究存在一定局限性。盡管本研究結果初步顯示持續的荷瘤狀態可易化POCD發生，且這一現象可能與荷瘤小鼠手術后體循環中高表達的IL-6有關，但并未對IL-6進行干預以證實其與POCD的真正相關性，也未能找到其準確的細胞來源，有待今后就上述問題進一步研究。

綜上所述，本研究證明了與普通小鼠相比，荷瘤小鼠更容易發生POCD，伴隨海馬組織中神經營養分子s APPα表達降低，其原因可能與荷瘤狀態加重手術導致的外周免疫反應和促進中樞炎性反應有關。對該領域的進一步研究將促進對POCD的理解，并有助于改善腫瘤患者的術后精神狀態。