白細胞介素-6中和抗體對小鼠缺血性腦損傷的影響

周雨曦 聞大翔 俞衛鋒 杭燕南

急性缺血性腦卒中為最常見的腦卒中類型，且溶栓治療窗短，因此患者極易發生遠期神經功能障礙，如肌力降低、認知障礙等問題。當腦血管急性堵塞時，中心區域為完全梗死區，而周邊腦組織發生急性炎性反應，若未得到及時有效的治療，會發生壞死加重損傷。抗炎治療可針對梗死區周邊腦組織產生保護作用，是重要的治療方法［1］。研究［2-3］結果表明，缺血性腦卒中患者血清IL-6水平升高，且IL-6水平與患者的腦梗死體積、不良預后呈正相關。本研究旨在探討IL-6中和抗體處理對缺血性腦卒中小鼠的腦梗死體積、腦組織急性炎性反應和腦梗死長期預后（腦梗死后28 d）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 健康成年雄性C57小鼠（清潔級）60只，平均體重為（30±5）g，由原第二軍醫大學動物中心提供。吸入麻醉藥七氟烷為上海恒瑞醫藥有限公司產品，IL-6中和抗體（MP5-20F3）和IgG同源對照抗體均為美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品，CD3兔抗小鼠中和抗體為艾博抗（上海）貿易有限公司產品，Iba-1兔抗小鼠中和抗體為日本和光純藥工業株式會社產品。小動物麻醉機為美國肯特科技公司產品，冰凍切片機為美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品，熒光顯微鏡為德國卡爾·蔡司股份公司產品。

1.2 實驗小鼠的飼養和分組 將60只小鼠隨機分為假手術組、IL-6中和抗體處理組和IgG對照組，每組20只。小鼠手術前后均于實驗室動物房內飼養，自由飲食，室溫維持20～22℃，每12 h日夜交替。

1.3 小鼠腦缺血模型制作和分組處理 用體積分數為0.02的七氟烷、0.30的氧氣和0.68的一氧化二氮混合氣體麻醉小鼠，用小動物麻醉機控制呼吸，溫控加熱板將小鼠術中直腸溫度維持于（37.0±0.5）℃。IL-6中和抗體處理組和IgG對照組小鼠行大腦中動脈遠端栓塞術，取頸部正中切口，分離迷走神經，結扎左側頸總動脈，縫合頸部切口；在小鼠左眼與左耳之間切開皮膚約1 cm，使用雙極電凝器游離顳肌，用顱鉆切開顱骨暴露大腦中動脈；隨后移除腦膜，使用雙極電凝器凝斷遠端大腦中動脈及其分支。假手術組小鼠采用同樣的麻醉和手術方法，但不阻斷頸總動脈和大腦中動脈［4］。術后2 h，IL-6中和抗體處理組小鼠于腹腔內注射IL-6中和抗體600μg／kg，IgG對照組小鼠于腹腔內注射IgG同源對照抗體600μg／kg。

1.4 計算腦梗死體積 每組取6只小鼠，在術后3 d斷頭取腦，去除嗅球和腦干部分，置于冠狀腦模具中連續切成1 mm腦片，共7片。將切片置于2%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液中孵育30 min，4%多聚甲醛溶液固定，無法被TTC染色的白色區域為缺血梗死區。應用Image J軟件計算梗死面積，梗死體積=梗死面積×腦片厚度（1 mm）。校正腦水腫后的實際腦梗死體積=梗死對側半球體積-梗死同側非梗死區域體積。

1.5 免疫熒光染色和熒光顯微鏡觀察 每組取4只小鼠，在術后3 d用2%戊巴比妥麻醉，經左心室快速灌注0.9%氯化鈉溶液40 m L后，繼續灌注4%多聚甲醛溶液40 m L。目前已知，腦組織中固有的小膠質細胞和外周浸潤的T淋巴細胞是受損腦組織炎性細胞因子的主要來源。采用CD3抗體標記T淋巴細胞，Iba-1抗體標記小膠質細胞。取腦組織依次置于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中至腦組織沉底，1 d后行冰凍切片，厚度為25μm。以5%牛血清白蛋白室溫封閉腦片1 h，加入CD3抗體（1∶200）、Iba-1抗體（1∶1 000），于4℃孵育過夜，室溫漂洗后加入驢抗兔紅色熒光二抗稀釋液（1∶1 000），再室溫孵育2 h，漂洗后貼片、晾干后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍攝有效圖像，計數腦梗死周邊區域陽性細胞數。

1.6 行為學評估

1.6.1 神經功能評分 每組各取10只小鼠，分別于腦卒中術前和術后3、5、7、14、21、28 d，采用改良Garcia評分從肢體感覺、爬行能力、轉向能力、肢體對稱性和前肢運動能力5個方面進行評分，每項0～3分，神經功能總評分15分，得分越低提示神經損傷越嚴重［5］。

1.6.2 感覺運動功能測試 每組取進行神經功能評分的10只小鼠行黏紙實驗，均以相同的壓力在小鼠的損傷側前爪粘貼大小為0.3 cm×0.4 cm的黏紙，隨后將小鼠放于透明觀察盒中，記錄小鼠感知和撕除黏紙的時間，最長時限為120 s。缺血性腦卒中后，小鼠感覺運動功能受損，感知并撕除黏紙所需時間延長，時間越長提示感覺運動功能受損越嚴重。小鼠術前連續3 d每天訓練1次，記錄基礎值，測試當日測試1次，記錄每周3個測試日數據的平均值作為該周感覺運動功能的評估指標［6］。在造模后第3～5天（第1周）、第10～12天（第2周）、第17～19天（第3周）、第24～26天（第4周）對小鼠進行感覺運動功能測試，計算術后第1～4周感覺運動功能的評估指標。

1.7 統計學處理 應用SPSS 22.0統計學軟件。呈正態分布的計量資料以x-±s表示，呈非正態分布的計量資料以中位數和四分位數表示。組間比較采用單因素方差分析或重復測量數據的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腦梗死體積比較 術后3 d，假手術組、IL-6中和抗體處理組和IgG對照組的腦梗死體積分別為0.45（0，1.05）、（14.9±2.2）和 （18.0±1.4）mm3，IL-6中和抗體處理組和IgG對照組均顯著大于假手術組（P值均＜0.01），但IL-6中和抗體處理組顯著小于IgG對照組（P＜0.05）。

2.2 腦梗死周邊區域炎性細胞比較 術后3 d，IL-6中和抗體處理組腦梗死周邊區域CD3+細胞數目和Iba-1+細胞數目分別為（27.06±3.01）和（56.81±3.47）個／mm3，IgG 對 照 組 分 別 為（51.73±3.99）和（99.88±3.63）個／mm3，IL-6中和抗體處理組腦梗死周邊區域CD3+細胞數目和Iba-1+細胞數目均顯著少于IgG對照組（P值均＜0.05）。見圖1。

圖1 IL-6中和抗體處理組和IgG對照組小鼠術后3 d腦組織免疫熒光染色結果

2.3 神經功能評分比較 3組小鼠術前的神經功能總評分的差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。在術后3、5、7、14、21、28 d，IgG 對照組和IL-6中和抗體處理組小鼠的神經功能總評分均顯著低于假手術組（P值均＜0.01）。在術后5、7、14、28 d，IL-6中和抗體處理組小鼠的神經功能總評分均顯著高于Ig G對照組（P值分別＜0.01、 0.05）。見表1。

表1 3組小鼠腦缺血后神經功能總評分比較（N=10，x-±s，分）

2.4 黏紙實驗結果比較 3組小鼠術前撕除黏紙時間的差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。術后第1、2、3、4周，IgG對照組小鼠撕除黏紙時間均顯著長于假手術組（P值分別＜0.01、0.05）。術后第1周，IL-6中和抗體處理組小鼠撕除黏紙時間顯著長于假手術組（P＜0.01）。術后第1、2周，IL-6中和抗體處理組小鼠撕除黏紙時間均顯著短于IgG對照組（P值均＜0.01）。見表2。

表2 3組小鼠撕除黏紙時間比較（N=10，x-±s，s）

3 討 論

國內外研究結果表明，急性腦卒中患者血清IL-6水平升高［3，7］，且腦卒中患者發病6 h內腦脊液中IL-6水平與24 h腦梗死體積呈正相關［8］，提示IL-6參與了損傷早期的急性炎性反應。IL-6水平與多種循環和神經系統疾病相關，心房顫動患者的IL-6水平與腦卒中和大出血相關，也是血栓形成和死亡的危險因素［9］；IL-6水平高的中年患者較IL-6水平低者，在10年內更易發生認知功能下降［10］。盡管升高的IL-6水平與腦卒中后致死致殘率相關，但亦有研究結果表明IL-6可在腦卒中后發揮神經保護功能，這提示外周和中樞系統的IL-6可能在不同時間點發揮不同的作用。

IL-6與其受體結合后可激活兩種細胞內信號通路——經典信號通路和反式信號通路，從而產生不同的生物學反應。經典信號通路可發揮抗炎、促細胞新生和神經保護作用，而反式信號通路具有促炎效應。缺血性腦梗死發生后，多效性細胞因子IL-6激活后的生物學效應復雜且尚未完全闡明，主要包括促炎和營養神經兩方面效應：①在腦梗死急性期可作為促炎細胞因子上調黏附分子表達促進淋巴細胞募集，加重腦組織損傷；②在腦梗死亞急性期和遠期，可作為神經營養因子，促進血管和神經元新生［11］。在腦梗死的不同臨床分期，通過干預IL-6對預后產生影響仍存在爭議。近期研究［12］結果表明，單純靜脈注射IL-6細胞因子可改善缺血性腦卒中小鼠的運動功能，IL-6和可溶性IL-6受體共同注射可使腦梗死體積增大和浸潤的淋巴細胞數量增多。本研究主要關注腦梗死急性期IL-6中和抗體處理抑制腦組織急性期炎性反應的作用。

不同時相的IL-6表達對神經組織產生不同的作用，損傷前IL-6的正常表達或高水平表達可對神經損傷產生保護作用，但在神經損傷發生后再增加IL-6的表達，會加重神經損傷。本研究針對缺血性腦卒中后升高的IL-6予以中和抗體處理，減輕炎性反應。目前針對缺血性腦卒中急性期炎性反應的治療方法眾多，已有2期臨床試驗靜脈給予缺血性腦卒中患者IL-1受體拮抗劑（IL-1R）治療急性期炎性反應，可降低皮質醇水平，逆轉腦卒中急性期的免疫抑制狀態［13］。在動物模型中預先給予選擇性TNF-α抑制劑（3，6’-二硫代沙利度胺）可縮小腦梗死體積，減少神經元凋亡，改善神經功能。IL-6中和抗體治療也可減輕小鼠心臟移植急性排斥反應和保護急性免疫性心肌炎等。

缺血性腦卒中后的炎性反應進程中存在多種促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6。外周血、腦脊液和損傷處腦組織均可檢測到促炎細胞因子表達升高。IL-6等促炎細胞因子加重腦組織損傷的機制為多方面的，如誘導選擇素E、細胞間黏附因子1（ICAM-1）、血管細胞黏附因子（VCAM-1）表達，這些位于內皮細胞上的黏附因子與淋巴細胞表面的整合素結合，參與T淋巴細胞浸潤至中樞神經系統的過程；同時激活的淋巴細胞釋放神經毒性因子、蛋白水解酶，誘導內皮細胞釋放血小板激活因子、凝血因子Ⅷ等多種組織因子，促進凝血過程和血栓發生；聚集于腦血管中的淋巴細胞影響腦血流，前述過程均加重局部腦缺血損傷［11，14］。

本研究結果表明，IL-6中和抗體處理能明顯縮小小鼠腦缺血后的腦梗死體積，抑制急性炎性細胞對腦組織的浸潤，從而改善腦梗死后28 d的長期神經功能預后，提示IL-6中和抗體處理可能作為治療腦缺血損傷的有效方法。

綜上所述，缺血性腦卒中模型中IL-6中和抗體早期處理可能通過抑制急性期炎性反應以縮小腦梗死體積和改善感覺運動功能。通過IL-6中和抗體調節腦卒中后機體的炎性反應，為臨床治療策略和新藥研發轉化提供了新的思路。