膝骨關節炎實驗動物模型現狀研究進展

喻珮 劉璐 李志娟 付淵博 袁芳 李彬

[摘要] 參照《實驗動物國家標準》將膝骨關節炎模型分為小型動物模型、大中型動物模型及靈長類動物模型，并將國內外常用動物模型依據自發性模型、誘發性模型進行歸類。自發性模型包括天然自發模型、轉基因模型，誘發性模型分為飲食誘發、藥物注射誘發、手術誘發、制動誘發及寒冷誘發。不同模型的選擇以及造模方法的應用，各自適用于不同的研究目的。

[關鍵詞] 膝骨關節炎;動物模型;造模方法;研究進展

[中圖分類號] R-332? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）09（c）-0041-04

Research progress of experimental animal models of knee osteoarthritis

YU Pei1，2? ?LIU Lu1? ?LI Zhijuan1，2? ?FU Yuanbo1? ?YUAN Fang1? ?LI Bin1

1.Department of Acupuncture and Moxibustion， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University? Beijing Key Laboratory of Acupuncture Neuromodulation， Beijing? ?100010， China; 2.Graduate School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] According to National Standard for Laboratory Animals， knee osteoarthritis models are divided into small animal models， large and medium animal models and primate animal models. The commonly used animal models at home and abroad are classified according to spontaneous model and induced model. Spontaneous model includes natural spontaneous model and genetically modified model， while inductive model includes diet induction model， drug injection induction model， operation induction model， braking induction model and cold induction model. The selection of different models and the application of modeling methods are suitable for different research purposes.

[Key words] Knee osteoarthritis; Animal models; Induced model methods; Research progress

膝骨關節炎（KOA）是老年多發、以關節軟骨退變為主要特征的疾病，在65～75歲人群中發病率達50%[1]，是伴隨人口老齡化逐漸成為影響人類健康的重要因素之一。實驗動物模型是研究疾病發展必不可少的工具，KOA模型主要分為兩類：①自發性模型，指無人為干預自然產生;②誘發性模型，指通過人為干預誘導產生。由于KOA機制復雜，理想動物模型的構建對于研究其發病機制及療效評價尤為重要。

1 模型分類

1.1 小型動物模型

據《實驗動物國家標準》，KOA小型動物模型主要由鼠類構成，早期表現出類似人KOA特征，包括蛋白聚糖丟失、軟骨纖維化、骨贅形成等[2]。同時生命周期短，便于觀察KOA進程，為研究其病變機制提供了新思路。然而鼠類關節腔較小，造模操作存在難度，指標測量有限制。

1.2 大中型動物模型

大中型動物模型主要包括兔、狗、豬、羊、馬，此類模型具有更大關節腔，便于診斷與造模。其中豬的解剖結構、軟骨膠原纖維都與人契合度較高[3]，同時轉基因技術已被允許應用于豬的轉化研究[4]。狗被部分學者認為解剖結構最接近研究標準，也更順從于術后管理[5-6]。此類模型不足之處在于飼養負擔重、疾病進展緩慢、觀察周期長、術后管理困難。

1.3 靈長類動物模型

靈長類模型由于生命周期長，且基因組與人相似度高，更適用于實驗研究。現今靈長類模型主要選擇獼猴類，但獼猴以四肢著地行走為主，與人類發病年齡段不同;且靈長類飼養價格昂貴，條件苛刻，繁殖速度慢，后期進行標本采集時倫理考慮也更困難。

2 模型建立

2.1自發性模型

2.1.1 天然自發模型

部分動物可因自身關節軟骨退變形成KOA。Liu等[7]在調查獼猴自發KOA中觀察到年老組較年少組膝關節周長增加，軟骨厚度降低，軟骨細胞減少。Staines等[8]發現，鼠可自發形成KOA，與內在結構、基因控制及母胎影響皆有聯系。但自發過程耗時較長，難以應用于實驗觀察，研究者們為此做出改善，高寧陽等[9]在黑鼠自發KOA基礎上強迫跑步30 min/d，KOA自發率顯著提高。

2.1.2 轉基因模型

隨著轉基因技術發展，KOA動物模型也可通過轉基因實現。Rodriguez等[10]發現，敲除小鼠Col11a1基因，可導致Ⅺ型膠原不能合成正常膠原纖維，誘導KOA。此外還有Col9a1、Col2a1基因，銅轉運基因，MMP-13基因，組織特異性BMP-1a型受體，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、a-1整合素基因、纖維調節素和基膜聚糖基因雙鏈，纖維調節素和二聚糖基因單鏈或雙鏈皆可誘發KOA[11]。

然而自發性KOA是由多基因調控產生，轉基因模型可能簡化疾病過程，因此治療措施不能相對應用于人KOA治療中[12]。另外，轉基因模型雖對研究KOA發病的特殊基因或蛋白質十分重要，卻是由基因異常產生，與勞累、環境等常見因素不符，造模成本也較高，因此能否作為KOA研究或療效評定的普通模型尚存在爭議。

2.2 誘發性模型

2.2.1 飲食誘發

臨床病因學顯示高脂飲食是一個對于負重或非負重誘發KOA的均相關因素。Lu等[13]發現伴隨人膳食結構中總脂肪及飽和脂肪酸攝入的增加，關節間隙逐漸變窄。Brunner等[14]發現，通過增加兔膳食脂肪的攝入，可在不增加體重基礎上造成軟骨黏多糖含量降低，同時抑制蛋白聚糖酶表達。在實驗鼠模型中，高脂飲食可提高瘦素、脂聯素水平，同時促進IL-1α分泌，誘導KOA[15]。

2.2.2 藥物注射誘發

2.2.2.1 碘乙酸鹽（MIA）? MIA可抑制Krebs循環的甘油醛-3-磷酸脫氫酶，導致軟骨細胞死亡[16]。Jacobs等[17]將MIA注入大鼠膝關節腔，4周后觀察到大鼠步態畸形，組織病理示關節軟骨缺損、細胞排列紊亂，骨贅形成。Nagy等[18]向大鼠關節腔注射MIA，3周后造模組組織病理學評分明顯高于對照組，且關節軟骨表面分層、缺失，纖維組織排布散亂。

2.2.2.2 木瓜蛋白酶? 木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，可分解軟骨中的蛋白多糖。Sukur等[19]向大鼠膝關節腔注射木瓜蛋白酶+乙酸鈉進行造模，28 d后蘇木精-伊紅（HE）染色顯示軟骨表面不規則、裂縫形成，軟骨細胞分布不均等KOA改變。Lin等[20]向大鼠關節腔注射木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸磷酸鹽混合液，12周后通過放射電子顯微鏡觀察到軟骨表面破壞，軟骨細胞核固縮、壞死等現象。

2.2.2.3 膠原蛋白酶? 膠原蛋白酶能破壞軟骨內Ⅰ型膠原，使肌腱和韌帶中膠原基質減少，造成關節穩態失衡。Nirmal等[21]向大鼠膝關節腔注射膠原蛋白酶Ⅱ，3周后關節軟骨部分缺失，關節間隙變窄，組織病理顯示軟骨表面不規則，骨贅形成及單核細胞浸潤等現象。Jeong等[22]向實驗鼠關節腔注射膠原蛋白酶進行造模，12 d后發現滑膜液IL-6、TNF-α、IL-1β分泌增多，組織病理示滑膜表面損耗，軟骨蛋白聚糖減少，纖維組織排布散亂。

2.2.2.4 尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）? uPA是一種蛋白酶，可降解軟骨基質的蛋白多糖，造成軟骨破壞。Shuang等[23]將SD鼠隨機分至實驗組與對照組，實驗組關節腔內注射uPA+生理鹽水，對照組僅注射生理鹽水，于1、2、4、6、8周進行步態分析。實驗組行走區域和速度均降低，搖擺步態明顯;8周后實驗組關節軟骨破壞、滑膜細胞增殖明顯，同時淋巴細胞浸潤、IL-1β、TNF-α分泌增多。

2.2.3 寒冷誘發

寒冷主要通過刺激關節液成分變化來影響滑膜通透性，改變軟骨內環境，誘發KOA。劉安軍等[24]采用寒冷刺激對小鼠進行造模，30 d后發現造模組關節炎指數明顯增高，病理結果及血清透明質酸、TNF-α的升高也表現出典型KOA病變。林強等[25]通過石膏將大鼠四肢固定于4℃涼水中，每日4 h，6周后發現大鼠血清及滑膜組織中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2及γ干擾素含量均上升。

2.2.4 制動誘發

膝關節長期固定，關節應力發生改變會出現肌肉萎縮、韌帶組織紊亂、半月板血流減少等現象，最終導致與臨床相似的KOA樣改變。Campbell等[26]將實驗鼠下肢固定于屈曲位，32周后通過免疫組織染色觀察到膝關節前部軟骨變薄，COL-Ⅰ增多、COL-Ⅱ減少、血管從軟骨轉移到軟骨下骨生長等現象，提示骨替代了關節軟骨的生長。

2.2.5 手術誘發

2.2.5.1 前交叉韌帶橫斷術（ACLT）? ACLT是現今采用較多的構建KOA模型方法之一，主要通過打破關節內穩定性來誘導軟骨退變。Tawonsawatruk等[27]通過ACLT對大鼠造模，分別于4、8、12周進行組織病理學評分，造模組明顯高于對照組;12周后HE染色顯示造模組軟骨細胞減少且分布不均。Levillain等[28]利用ACLT對兔進行KOA造模，6周后通過共聚焦顯微鏡和組織染色觀察到關節軟骨表面磨損、骨贅形成、軟骨纖維排布混亂等改變。ACLT造模成功率高，但僅截斷前交叉韌帶對膝關節應力破壞較小，常與半月板切除（MMT）搭配使用。

2.2.5.2 MMT? 半月板具有穩定膝關節、緩沖震蕩、減少摩擦等作用，半月板缺失可導致膝關節穩定性下降、磨損加重。Bagi等[29]對大鼠進行MMT造模，10周后采取膝關節斷層掃描，顯示軟骨表面不規則、局部受損，骨贅形成。Parrish等[30]采取MMT對大鼠進行KOA造模，術后恢復負重，3周后組織病理染色示關節軟骨鈣化，軟骨下骨硬化及骨贅形成等KOA改變。MMT主要影響關節穩定性，與軟骨破壞等無直接關系，可用于KOA應力學研究。

2.2.5.3 Hulth法? Hulth法操作是在手術顯微鏡下打開關節腔，切斷內側副韌帶及前后交叉韌帶、切除內側半月板，5周后得到KOA模型。原理為破壞膝關節穩定性造成應力不均，誘導軟骨退變。Rogart等[31]利用Hulth法對兔進行造模，分別在3周與14周末對兔關節軟骨COL-Ⅱ進行分析，結果顯示3周末關節軟骨中COL-Ⅱ即開始降解，14周末降解更為嚴重。

2.2.5.4 膝關節刻痕法? Marijnissen等[32]首先對犬使用圓絞刀進行軟骨劃痕，于術后強迫以術肢負重，每日4 h，每周3 d，20周后發現局部軟骨細胞出現變性、基質中異染物質消失等KOA病理改變。李釗等[33]使用小針刀對兔脛骨平臺及股骨髁軟骨進行表面刻痕，術后強迫活動30 min/d，5周后HE染色部分軟骨面糜爛，軟骨細胞減少、分布不均等變化。刻痕法不打開關節腔，減少了手術創傷，成功率高，耗時較短，在研究KOA軟骨修復上是一種理想模型。

3 小結

自發性模型不需干預，受到外界干擾較少，可盡量避免操作誤差造成的影響，更貼近人KOA進程，但由于進展緩慢限制了在研究中的應用。藥物誘發模型操作簡單、耗時較短、可重復性高，在短期研究中具有一定可行性。同時具有不破壞關節穩定性，不損傷關節結構等優點，但引發的關節內炎癥大多造成軟骨細胞的死亡[34]，而人KOA主要以軟骨磨損退化、骨贅形成等變化為主，二者在病理上存在一定差異。因此，藥物誘發模型更適于研究炎癥或疼痛機制，以及療效評定的觀察。

近年手術誘導以病因明確、成功率高、穩定性好成為KOA造模常用方法，主要以破壞關節軟骨、半月板或交叉韌帶來打破關節穩定性，更加符合創傷性KOA過程，對于研究創傷性KOA軟骨保護和修復是一種理想模型。同時，采取多種手術方法聯合造模效果優于單一手術造模，且耗時較少[35]。Zhou等[36]比較采用前后交叉韌帶、內側副韌帶橫斷+MMT，ACLT+股骨髁劃痕法，單獨ACLT對獼猴進行造模。8周后觀察到滑膜液WBC、IL-1β、TGF-β1分泌量，關節軟骨COL-Ⅱ、ACAN和MMP-13含量以及形態學評分均為前后交叉韌帶、內側副韌帶橫斷+MMT組>ACLT+股骨髁劃痕組=老年獼猴自發KOA組>單獨ACLT組>假手術組>空白組，表明多種方法聯合造模效果優于單一方法。由此可見，在現代研究中應不拘一格，采用更有效的多種方法聯合造模，為實驗研究創造更多便捷。

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