調(diào)經(jīng)丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陸 穎，王玉龍，何 越

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000）

月經(jīng)失調(diào)是現(xiàn)代女性中多見的婦科病，表現(xiàn)為月經(jīng)周期的紊亂或出血量的異常，同時(shí)可能出現(xiàn)月經(jīng)前、經(jīng)期時(shí)的腹痛及全身癥狀[1]。現(xiàn)在西醫(yī)學(xué)在月經(jīng)不調(diào)的治療方法上以使用雌孕激素來調(diào)節(jié)月經(jīng)周期以及促進(jìn)排卵為主[2]，雖然短期內(nèi)效果明顯，但是副作用大，且停藥后病情可能會復(fù)發(fā)。中醫(yī)在月經(jīng)不調(diào)的治療注重整體觀念，審因論治，根據(jù)患者經(jīng)期時(shí)的實(shí)際情況分析，制定合理的治療方案，針對病因以內(nèi)服中藥配合針灸等方法調(diào)整周期。本院針對此病機(jī)確立了補(bǔ)氣健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的治法，精選處方，研制了醫(yī)院制劑“調(diào)經(jīng)丸”，主要功效為理氣和血，調(diào)經(jīng)止痛。臨床研究顯示，與西藥（如黃體酮）相比，本制劑兼顧病因、病癥，標(biāo)本兼治，療效突出，副作用小，無明顯毒副作用，有很大的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥品與試劑

3批調(diào)經(jīng)丸樣品（批號：20160116、20160803、20170110；鹽城市中醫(yī)院）；阿魏酸對照品（批號：110773-201614；中國食品藥品檢定研究院）；丹參酮LlA對照品（批號：110766-201520；中國食品藥品檢定研究院）；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201515；中國食品藥品檢定研究院）；試驗(yàn)中用到的試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

紫外分析儀3650A；薄層色譜攝像儀；FW177型中草藥粉碎機(jī)；BP211D型分析天平；KQ-500型超聲波清洗器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 調(diào)節(jié)丸中活性成分的薄層色譜鑒別

2.1.1 當(dāng)歸的薄層鑒別[2-3]

2.1.1.1 供試品的制備

用研缽對調(diào)經(jīng)丸進(jìn)行研磨，再使用精確到0.01 g的電子天平稱取調(diào)經(jīng)丸細(xì)粉2 g，將其倒入錐形瓶中，加水10 mL使其溶解，再加入乙醇40 mL，用玻璃棒攪拌均勻。將溶液倒入蒸發(fā)皿中，用水浴鍋加熱使乙醇揮發(fā)，濃縮到15 mL左右，倒入分液漏斗中，用蒸餾水蕩洗蒸發(fā)皿，洗滌液倒入分液漏斗中。用15 mL乙醚提取溶液中的有效成分，提取兩次，將上述提取所得的兩次乙醚液放置同一容器中，再加入2% Na2CO3溶液振搖萃取2次，一次加入15 mL，將乙醚層倒掉，在提取液滴加適量Hcl溶液調(diào)整pH值至2-3，用少量苯萃取，倒掉苯液，再用乙醚充分搖勻萃取2次，分別使用30 mL，將2次萃取的乙醚液混合，將上述提取所得的兩次乙醚液放置同一蒸發(fā)皿中，并且置于水浴鍋上揮干溶劑，揮干后所得殘留物中加乙醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對照品的制備

對照品溶液：使用精確到0.01 g的電子天平稱量當(dāng)歸對照藥材3 g，置于磨口錐形瓶中，使用移液管精密量取100 mL蒸餾水加入容器中，浸泡1 h后，裝上回流裝置，進(jìn)行加熱回流，回流以保持溶液微沸狀態(tài)最佳，加熱回流溶液1 h；再用干燥的過濾器進(jìn)行濾過，將濾液接于適宜大小的蒸發(fā)皿中，放在水浴鍋上加熱濃縮至10 mL，用15 mL乙醚提取溶液中的有效成分，提取兩次，將兩次萃取的乙醚液混合，放置同一蒸發(fā)皿中，并且置于水浴鍋上揮干溶劑，向蒸干后所得的殘留物中加入乙醇1～2 mL使其溶解，即得對照藥材溶液。

陰性對照品溶液：按本品處方比例稱取除當(dāng)歸外的各藥材,按本品制備工藝制備缺當(dāng)歸的陰性對照樣品,按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

阿魏酸對照品溶液：使用分析天平精密稱定阿魏酸對照品10.0038 mg，用移液管精密量取甲醇溶液5 mL，將對照品溶解，配制濃度為2.0019 mg/mL的對照溶液（選用棕色容量瓶且放入冰箱冷藏待用）。

2.1.1.3 展開條件

點(diǎn)樣體積：5～10 μL；硅膠板：硅膠G板；展開劑：以20：1：3的比例，稱取完全飽和苯20 mL、冰醋酸1 mL及甲醇3 mL溶液，于燒杯中混合配制成展開劑，點(diǎn)樣前提前20分鐘將展開劑倒入展開缸中，使展開缸飽和；紫外光燈檢測波長：365 nm；展距：10 cm。

2.1.2 丹參的薄層鑒別[8-9]

2.1.2.1 供試品溶液的制備

用研缽對調(diào)經(jīng)丸進(jìn)行研磨，再使用精確到0.01 g的電子天平稱取調(diào)經(jīng)丸細(xì)粉2 g，將其倒入磨砂口錐形瓶中，向錐形瓶中加入甲醇30 mL，用玻璃棒攪拌均勻，超聲處理0.5 h。再用干燥的過濾器進(jìn)行濾過，放置同一蒸發(fā)皿中，并置于水浴鍋上將甲醇蒸干。揮干后再向蒸發(fā)皿中加水20 mL溶解殘留物，溶液倒入分液漏斗中，使用20 mL乙醚進(jìn)行萃取，前后三次，將提取的乙醚層混合，倒入同一蒸發(fā)皿中，并在水浴鍋上揮干溶劑，向蒸干后所得的殘留物中加入乙醇1～2 mL使其溶解，即得供試品溶液。

2.1.2.2 對照品溶液的制備

陰性對照溶液：按照2.1.1.2項(xiàng)下的處理方法制備缺丹參的陰性對照溶液；丹參酮對照品溶液：用分析天平精密稱取丹參酮IIa對照品10.0132 mg，加甲醇溶液10 mL使其溶解，制成濃度為1.0132 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2.3 薄層色譜條件

點(diǎn)樣體積：5～10 μL；硅膠板：硅膠G板；展開劑1：以6:4:8:1:4的比例，稱取三氣甲烷12 mL、甲苯8 mL、乙酸乙酯16 mL、甲醇2 mL及甲酸8 mL溶液，于燒杯中混合配制成展開劑，點(diǎn)樣前提前20分鐘將展開劑倒入展開缸中，使展開缸飽和；展開劑2：以4:1的比例，量取石油醚（60～90°C）16 mL及乙酸乙酯4 mL溶液，于燒杯中混合配制成展開劑，點(diǎn)樣前提前20分鐘將展開劑倒入展開缸中，使展開缸飽和；紫外光燈檢測波長：365 nm；展距8 cm（展開劑1展開）、4 cm（展開劑2展開）。

2.1.3 黃芪的薄層鑒別[10-11]

2.1.3.1 供試品的制備

用研缽對調(diào)經(jīng)丸進(jìn)行研磨，再使用精確到0.01 g的電子天平稱取調(diào)經(jīng)丸細(xì)粉2 g，將其倒入錐形瓶中，向錐形瓶中加入蒸餾水20 mL，用玻璃棒攪拌均勻，超聲處理0.5 h，再用干燥的過濾器進(jìn)行濾過，濾過的清液用水飽和的正丁醇萃取3次，分別加入15 mL，將正丁醇層溶液混合，用氨水洗滌3次，分別使用15 mL，取用非氨水層，再用正丁醇飽和的水萃取3次，每一次加入15 mL，取用正丁醇層并混合，倒入同一蒸發(fā)皿中，并且置于水浴鍋上蒸干溶劑，向蒸干后所得的殘留物加入甲醇適量使其溶解，即得供試品溶液。

2.1.3.2 對照品的制備

陰性對照品溶液：按照2.1.1.2項(xiàng)下的處理方法制備缺黃芪的陰性對照品溶液；對照藥材溶液：再使用精確到0.01 g的電子天平稱取黃芪對照藥材3 g，放入250 mL規(guī)格的錐形瓶中，用移液管精密量取100 mL蒸餾水加入錐形瓶中，浸泡1 h后，裝上回流裝置，加熱回流，回流以保持溶液微沸狀態(tài)最佳，加熱回流溶液1h；用干燥的過濾器進(jìn)行過濾，將濾液加熱蒸發(fā)至20 mL，按2.2.3.1項(xiàng)下的處理方法配得對照藥材溶液；甲苷對照品溶液：使用分析天平精密稱取黃芪甲苷對照品10.0218 mg，加甲醇10 mL使其溶解，配得濃度為1.0218 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3.3 薄層色譜條件

點(diǎn)樣體積：5～10 μL；硅膠板：硅膠G板；展開劑：以20：5：1的比例，稱取二氯甲烷20 mL、甲醇5 mL及水1 mL溶液，于燒杯中混合配制成展開劑，點(diǎn)樣前提前20分鐘將展開劑倒入已用氨氣飽和完全的展開缸中，使展開缸飽和；紫外光燈檢測波長：365 nm；加熱溫度：105℃；顯色劑：10%硫酸乙醇溶液；展距：10 cm。

2.2 調(diào)節(jié)丸中當(dāng)歸的定量分析[4-5]

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的根，有活血化瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等功效，也為調(diào)經(jīng)丸中的主要活性成分之一[12]。其中，當(dāng)歸的化學(xué)成分大概可以劃分為兩個(gè)主要部分，分別是以藁本內(nèi)酯為主的揮發(fā)油部分和以阿魏酸及多糖為主的水溶性部分[13]。當(dāng)歸中的阿魏酸可以在缺氧的條件下保護(hù)心肌活動(dòng)，主要機(jī)制是保護(hù)線粒和增加心肌血流量，從而增加心肌的抗缺氧能力[6]。

2.2.1 色譜分離條件

色譜柱：C18；流動(dòng)相：甲醇-0.083%磷酸（29:71）；流速：1 ml/min；檢測波長：316 nm；柱溫：30℃。

2.2.2 對照品溶液的配制

使用分析天平精密取阿魏酸對照品（1 1 0 7 7 3-201614批）10.00 mg，將其加入100 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑溶解并定容到刻度，制得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，搖勻放入暗處冷藏待用。

2.2.3 供試品溶液的配制

用研缽對調(diào)經(jīng)丸進(jìn)行研磨,使用精確到0.0001 g的天平稱取稱取細(xì)粉5 g，，放入150 mL規(guī)格的磨口錐形瓶中中，用移液管準(zhǔn)確移取70%甲醇50 mL，超聲提取0.5 h，用干燥的過濾器進(jìn)行濾過，溶液放于蒸發(fā)皿中，放于水浴鍋上體積濃縮至10 mL，選用適宜規(guī)格的的細(xì)孔濾膜濾過，即得供試品[7]。

2.2.4 線性關(guān)系考察

取2.2.2項(xiàng)下制備的阿魏酸對照品溶液，精密吸取對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，搖勻，制得濃度分別為0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取上述對照液各10 μL注入高效液相色譜儀，記錄不同濃度的阿魏酸對照品的峰面積。以阿魏酸的進(jìn)樣量（μL）作為橫坐標(biāo)，不同濃度對照品的峰面積（A）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其回歸方程[8]。

2.2.5 當(dāng)歸中阿魏酸的含量測定

精密吸取2.2.3項(xiàng)下制得的供試品溶液10 μL，分別進(jìn)3次樣，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)注曲線計(jì)算阿魏酸的含量。

3 結(jié) 果

3.1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別

在紫外燈365 nm波長下觀察色譜圖（如圖1）,樣品的薄層圖譜中,在對照藥材和對照品的對應(yīng)位置上,可看到相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，缺當(dāng)歸的陰性對照沒有干擾。

3.2 丹參的薄層色譜鑒別

將硅膠板放在紫外光燈（365 nm）下檢視。樣品的薄層圖譜（如圖2）中,在與對照藥材和對照品的對應(yīng)位置上,可以看到相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，缺丹參的陰性對照沒有干擾。

3.3 黃芪的薄層色譜鑒別

在紫外燈365 nm波長下觀察色譜圖（如圖3）,在與對照藥材和對照品的對應(yīng)位置上,均可以看到棕褐色熒光斑點(diǎn)，缺黃芪的陰性對照無干擾。

圖1 當(dāng)歸薄層圖譜

圖2 丹參薄層圖譜

圖3 黃芪薄層圖譜

3.4 調(diào)節(jié)丸中當(dāng)歸的定量分析

圖4中，樣品分離狀況良好，（其中A圖為對照品圖譜，B圖為樣品圖譜）。在2.2.4條件下考察的線性關(guān)系如圖5所示，計(jì)算所得回歸方程為y=6E+07x+10195，r=0.9998，表明阿魏酸在0.01～0.04 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出阿魏酸的含量為0.0195 mg/g。

圖4 阿魏酸對照品及調(diào)經(jīng)丸色譜圖

圖5 阿魏酸的回歸曲線

4 討 論

調(diào)經(jīng)丸是由當(dāng)歸、黃芪、黨參、炒白術(shù)、丹參、益母草、桃仁、紅花、制香附、赤芍、川牛膝以上十一味中藥材組成的。目前，調(diào)經(jīng)丸現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有常見的一般檢驗(yàn)，如理化鑒別等，缺乏具有特征性的薄層定性鑒別及高效液相色譜定量檢驗(yàn)方法[9]，為了有效地控制該制劑的質(zhì)量，故本科研小組借鑒了現(xiàn)代分析檢驗(yàn)技術(shù)并對照《中國藥典》（2015年版）要求，制定較為完整、專屬性強(qiáng)的定量定性檢驗(yàn)方法，加強(qiáng)對調(diào)經(jīng)丸質(zhì)量的穩(wěn)定性、可控性檢測，為醫(yī)院制劑的良性發(fā)展奠定基礎(chǔ)[10]。

按照本實(shí)驗(yàn)中的TLC方法可明顯看到當(dāng)歸、丹參和黃芪的特征斑點(diǎn)，所以，可以用上述方法對當(dāng)歸、丹參和黃芪進(jìn)行定性鑒別。由HPLC色譜圖可以看出，對照品溶液中阿魏酸的出峰時(shí)間約為24.733分鐘，根據(jù)對樣品的含量測定試驗(yàn)，計(jì)算得出調(diào)經(jīng)丸中阿魏酸的含量為19.95 μg/g。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在研究和創(chuàng)建調(diào)經(jīng)丸的質(zhì)量準(zhǔn)則。薄層色譜圖實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，本實(shí)驗(yàn)中采用的薄層色譜法對于鑒定調(diào)經(jīng)丸中是否含有當(dāng)歸、丹參及黃芪藥材，實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)果可靠，方法簡便、易于操作、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，可以被列入檢驗(yàn)調(diào)經(jīng)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一；而使用高效液相色譜法對調(diào)經(jīng)丸中阿魏酸進(jìn)行定量鑒別的方法，經(jīng)過對其方法學(xué)方面的考察，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，實(shí)驗(yàn)中建立的檢測方法簡單、靈敏、快速，符合含量測定的要求。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的TLC法和HPLC法可以被列入檢驗(yàn)及鑒定調(diào)經(jīng)丸的質(zhì)量的方法之一。但在測定阿魏酸含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)調(diào)經(jīng)丸中的阿魏酸較低，且成分較多，不易分離，可考慮在實(shí)驗(yàn)時(shí)對樣品中的阿魏酸進(jìn)行提取和富集，以達(dá)到減少雜質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響的目的。