16S rRNA測(cè)序法檢測(cè)倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)細(xì)菌種類(lèi)的研究

陳璟恒 張芙蕊 李和平

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

16S rRNA分子是研究細(xì)菌群落最佳靶分子，利用保守區(qū)序列設(shè)計(jì)通用引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用可變區(qū)序列來(lái)進(jìn)行種屬分類(lèi)[1]。目前，16S rRNA 測(cè)序是研究腸道微生物的重要方法之一，該方法可以對(duì)腸道微生物中的所有菌種進(jìn)行精確定量，因此正逐漸成為研究腸道微生物菌種豐度變化的主流[2]。

動(dòng)物的頰囊，又稱(chēng)食囊，是靈長(zhǎng)目(Primates)的獼猴(Macaca)和嚙齒目(Rodentia)的松鼠(Sciuridae)、蒙古黃鼠(Spermophilusdauricus)、倉(cāng)鼠(Cricetidae)等動(dòng)物的口腔內(nèi)兩側(cè)的一種特殊的囊狀結(jié)構(gòu)。靈長(zhǎng)目動(dòng)物的頰囊主要用于貯藏食物[3]，單孔目(Monotremata)動(dòng)物鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)的頰囊作用特殊，用于收集細(xì)小的砂石，幫助其磨碎幾丁質(zhì)或者其他堅(jiān)硬的食物[4]。倉(cāng)鼠的頰囊除儲(chǔ)存作用之外，還充當(dāng)氣囊，當(dāng)倉(cāng)鼠落水時(shí)，便會(huì)在頰囊中充氣，形成氣囊，能夠讓其把頭露出來(lái)游泳[5]。動(dòng)物的消化道中棲居著大量微生物，它們參與飼料的分解和轉(zhuǎn)化作用[6]。在倉(cāng)鼠頰囊中，其微生物(細(xì)菌菌落)棲居情況尚不清楚，因此，為了探明其微生物種類(lèi)，本研究利用16S rRNA 測(cè)序技術(shù)，通過(guò)分析倉(cāng)鼠頰囊微生物菌種豐度變化，來(lái)確定倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)細(xì)菌種類(lèi)，為倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)食物的消化生理作用提供基礎(chǔ)的科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自哈爾濱市大發(fā)市場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用倉(cāng)鼠5只。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 頰囊液體提取

將倉(cāng)鼠進(jìn)行口腔局部解剖，剝離出倉(cāng)鼠的頰囊，并保證頰囊不破裂，用BIORISE公司的OC-100 DNA樣本采集袋(含口腔拭子)插入倉(cāng)鼠頰囊，并進(jìn)行擦拭，待口腔拭子沾滿(mǎn)頰囊內(nèi)液時(shí)，迅速將口腔拭子插入裝有1 mL唾液保存液的唾液DNA收集器中。

1.2.2 16S rRNA提取及物種分析

將被倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)液體浸濕的口腔拭子插入上海朗賦生物科技有限公司生產(chǎn)的SAL2000L唾液樣本采集管中，讓拭子充分浸入唾液保存液中，立刻放入液氮罐中速凍后，送往深圳市華大基因有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

對(duì)粘有倉(cāng)鼠頰囊液體的口腔拭子進(jìn)行細(xì)菌的16S rRNA測(cè)序，并對(duì)細(xì)菌種類(lèi)進(jìn)行注釋分析。測(cè)序結(jié)果如表1所示，放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)占到了所鑒定菌群的三分之二，是最具有優(yōu)勢(shì)的菌門(mén)。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和放線(xiàn)菌綱(Actinobacteria)在所鑒定的菌群中占比也超過(guò)三分之二，是最具優(yōu)勢(shì)的菌綱。在細(xì)菌目水平，棒狀菌目(Corynebacteria)和乳桿菌目(Lactobacillales)以及丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)是最高頻菌目，其他菌目比例較低。在細(xì)菌科水平，最具優(yōu)勢(shì)的菌科分別為棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)、產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)。德克斯氏菌屬(Derxia)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)是現(xiàn)已知分類(lèi)的最具優(yōu)勢(shì)的菌屬。

表1 倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)細(xì)菌種類(lèi)及其豐度

Tab.1 The sorts and abundances of bacteria from hamster’s cheek pouches

3 討論

倉(cāng)鼠的主要食物為蔬菜類(lèi)、谷物類(lèi)、種子類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)，以谷物和少許豆類(lèi)為主[7]。從頰囊的物理性質(zhì)以及倉(cāng)鼠的食性判斷，頰囊并不具備通過(guò)扭轉(zhuǎn)等作用，將食物擠壓、磨碎的功能，倉(cāng)鼠也不會(huì)像鴨嘴獸一樣在頰囊中儲(chǔ)存細(xì)小的砂石，通過(guò)砂石磨碎幾丁質(zhì)與堅(jiān)硬的農(nóng)作物外殼[4]。

通過(guò)對(duì)倉(cāng)鼠頰囊內(nèi)液體進(jìn)行的16S rRNA細(xì)菌菌群分布結(jié)果可以看出，倉(cāng)鼠的頰囊中含有擬桿菌屬(Bacteroides)、色桿菌屬(Chromobacterium)、乳桿菌、德克斯氏菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)等。其中乳桿菌包括了雙歧乳桿菌種(Lactobacillus_animalis)、倉(cāng)鼠乳桿菌種(Lactobacillus_hamsteri)、口腔乳桿菌種(Lactobacillus_oris)，乳桿菌具有分解糖類(lèi)底物，產(chǎn)生各種功能性酶的作用[8]，因此這3種乳桿菌均對(duì)食物具有一定的消化作用。

乳桿菌在腸道中可有利于恢復(fù)腸道正常微生物群體的生態(tài)平衡，促進(jìn)消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[9]。腸道中的雙歧桿菌則可以調(diào)整菌群[8]，并分泌多種酶促進(jìn)鐵、鈣和維生素的吸收，某些產(chǎn)物還能改善蛋白質(zhì)的代謝[10]。由于倉(cāng)鼠將食物放在頰囊中的時(shí)間和頰囊中微生物含量是有局限性的[11]，因此可推斷，倉(cāng)鼠頰囊對(duì)食物并沒(méi)有直接的消化作用或消化作用不明顯，但食物在頰囊這個(gè)非干燥條件下的貯存，可以對(duì)食物之后的咀嚼與消化起到促進(jìn)作用。