電針干預對大鼠骨密度及骨髓間充質干細胞成脂分化的影響

曹夏，謝菊英，肖麗?

（1.湘南學院，湖南 郴州 423000；2.湘南學院附屬醫院，湖南 郴州 423000）

0 引言

絕經后骨質疏松癥((Post-menopausal osteoporosis,PMOP)主要發生在絕經后婦女，由于雌激素缺乏導致骨量減少及骨組織結構變化，使骨脆性增加易于骨折的一種全身代謝疾病。我國居民骨質疏松癥流行病學調查顯示，骨質疏松已經成為我國50 歲以上人群的重要健康問題，65 歲以上人群骨質疏松癥患病率達32.0 %。

骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有自我復制和多向分化能力，體外不同誘導條件下，能夠向成骨細胞、脂肪細胞等不同的細胞系分化[1]。研究發現絕經后骨質疏松癥引起的骨量減少往往與骨髓中脂肪組織增多相伴行[2]，通過抑制骨髓基質細胞的脂肪分化，可能達到預防和治療骨質疏松癥的作用[3]；因此本研究擬通過實驗證實電針對BMSCs 成骨和成脂分化的影響，探討其治療骨質疏松的可能機制。

1 材料和設備

1.1 實驗動物

健康未生育3 月齡SD 大鼠，48 只，SPF 級（Ⅱ級），雌性，體質量(230±20)g，由湘南學院動物實驗中心提供。

1.2 試劑和器材

0.25×13 mm 一次性不銹鋼毫針(華佗牌)，SDZ-Ⅱ型電針儀(華佗牌)，倒置相差顯微(Olympus)，DMEM 培養液(GIBCOBRL 公司),胎牛血清(GIBCOBRL 公司)，吲哚米沙星(Sigma 公司)，胰島素注射液(萬邦制藥)，地塞米松(Sigma 公司)，抗壞血酸(Sigma 公司)，CO2細胞孵箱(Heraeus)等。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備方法

將48 只雌性SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、雌激素組、電針組4 組，每組各12 只。模型制備：3 月齡SD 雌性大鼠SPF 級（Ⅱ級），造模前大鼠于室內適應性喂養1 w。術前禁食12 h，2 %戊巴比妥(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，從背側入路行雙測卵巢摘除術。術后每日肌注1.5 mL 青霉素（4 萬單位/mL）抗炎，連續3 d。所有實驗動物自由攝水和進食，飼養12 w。

2.2 干預措施

正常組：正常飼養，不做任何處理。模型組：行雙測卵巢摘除術造大鼠骨質疏松癥模型；雌激素組：造模后，尼爾雌醇l mg·kg-1 體重，使用前配成混懸液(濃度為0.167 mg/m1)，1 次/周灌胃，連續給藥12 w；電針組：造模成功后，選取主穴腎俞、脾俞、肝俞、膈俞、命門、關元、足三里、三陰交，并通電針儀刺激，以針體輕微顫動、大鼠能耐受為宜，留針10 分鐘。在模型成功既開始針刺，每日一次，十次一療程，療程間隔3 d，共治療12 w，7 個療程。

2.3 標本采用與檢測

2.3.1 骨密度檢測

實驗結束后處死大鼠，取出右側股骨，去除表面附著軟組織，保留骨膜，置于生理鹽水中，放入-80 ℃冰箱中保存，采用雙能X 線骨密度儀檢測股骨骨密度，單位為g/cm2，表示大鼠股骨掃描區域內每平方厘米含有的骨礦物質。

2.3.2 骨髓間充質干細胞的體外培養

以2%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下分離大鼠左側股骨，刮除骨膜和軟組織，切除股骨兩端。用5 mL DMEM 培養液沖出骨髓，吹散細胞，2000 r/min，離心10 min,棄上清。用DMEM 培養液3 mL 制成骨髓細胞懸液,貼壁緩慢加入裝有等體積淋巴細胞分離液的離心管中，2000 r/min，離心30 min。小心吸取界面層細胞，用DMEM 培養液洗兩次，收集細胞，血細胞計數板計數，以4×106/mL的密度接種于培養瓶，加入DMEM 全培養液(含10 %胎牛血清，25 mmol/L HEPES，100 U/mL 青霉素，100g/mL 鏈霉素)，置37 ℃，5 % CO2孵箱中，第5 d首次換液，棄懸浮細胞。第14 d 將融合生長的細胞以2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。

2.3.3 BMSCs 細胞表面標志物的鑒定

取生長狀態良好的P3 代細胞,傾棄培養液,用PBS 洗滌細胞兩遍,加入胰蛋白酶消化約2 min，在顯微鏡下見細胞變圓,有少量細胞懸浮時，加完全培養基終止反應，用PBS 清洗3 遍，1500 r/min 離心5 min，棄上清，加PBS 制成細胞懸液，用200 目篩網過濾，確定細胞濃度1×105個/mL，分別加入CD29、CD44、CD45 抗體，檢測相應的抗原表達量。

2.3.4 RT-PCR 法檢測成脂誘導后BMSCs 脂蛋白脂酶LPL-mRNA 的表達

成脂肪誘導后，培養第14 d，分別提取誘導的正常組、模型組、電針組、雌激素組MSCs 總RNA，運用RT-PCR 檢測LPLmRNA 的表達。細胞總RNA 的提取按TRIZOL 試劑說明書進行。利用GelPro 凝膠成像圖像分析系統對各組LPL 產物和GAPDH 進行半定量分析。記錄各條帶積分光密度(IOD)，將檢測基因與GAPDH 條帶IOD 相比較得到其相對IOD。

2.4 統計學分析

用SPSS 22.0 統計軟件對實驗數據進行分析，所有數據均用±s 表示，檢驗各組數據正態性、方差齊性，計量資料比較采用單因素的方差分析，組間比較采用 LSD 法。

3 結果

3.1 骨密度值比較

與正常組相比，模型組骨密度值較低，差異有統計學意義(P<0.01)，說明切除雙側卵巢后會導致骨質疏松的發生，模型制作成功。與模型組相比，雌激素組、電針組的骨密度值增高，差異有統計學意義(P<0.01)，但電針組和雌激素組之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明電針和雌激素治療均能減輕大鼠去卵巢后骨量丟失，且療效相似。見表1。

表1 各組大鼠右側股骨骨密度值 ±s（g/cm2）

注：與正常組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01。

3.2 BMSCs 細胞表面標志物的鑒定

結果顯示CD29、CD44 染色的P3 代 BMSCs 顯微鏡下呈綠色，染色率達 98.1 %和96.8 %，呈陽性表達，CD45 染色率1.32 %，呈陰性表達，表明所培養細胞為骨髓間充質干細胞，可用于后續實驗。

3.3 成脂誘導后BMSCs 脂蛋白脂酶（LPL）mRNA 的表達

成脂誘導后，模型組較正常組LPL-mRNA 表達增高（P<0.01），說明模型組BMSCs 成脂分化能力增強。雌激素組和電針組LPL-mRNA 表達低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01），說明雌激素和電針治療均能夠抑制BMSCs 的成脂分化。雌激素組和電針組比較，LPL-mRNA 表達差異無統計學意義（P>0.05）見表2。

表2 各組BMSCs 成脂誘導后LPL-mRNA 的表達（±s）

表2 各組BMSCs 成脂誘導后LPL-mRNA 的表達（±s）

注：與正常組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.01。

4 討論

骨質疏松癥是以骨量下降和微結構破壞為主要特征，有研究發現絕經后骨質疏松癥引起的骨量減少往往與骨髓中的脂肪組織增多相伴行[2]。在骨髓微環境中，成骨細胞與脂肪細胞都來源于BMSCs，絕經后的女性隨著年齡的增加，雌激素水平下降，成脂分化能力得到增強，成骨分化活動受到抑制[4]，由于成骨細胞與脂肪細胞兩者可以相互轉換，并且存在”此消彼長”的關系[5]。因此，抑制于BMSCs的脂肪分化、促進其成骨分化為骨質疏松癥的治療提供了新思路。但長期應用雌激素治療卻存在著使患乳腺癌、子宮內膜癌、心血管意外等疾病增加的風險。相對于藥物治療，針灸治療骨質疏松癥具有標本兼治、多靶點施治、無毒副作用等獨特優勢，運用針刺療法治療骨質疏松癥已得到廣泛運用并已有一定的理論支持[6-9]。鑒于此，本研究根據絕經后骨質疏松癥的中醫學病因病機“根本在于腎虛，涉及脾、肝，病理表現為精氣不足、骨髓空虛、骨質脆弱；其標是痰瘀阻絡、氣血失和，病邪侵襲以致癥狀出現而發本病”[10]，確立了以補腎健脾、疏肝活血針刺治療原則，選用腎俞、脾俞穴、肝俞、膈俞、命門、中脘、關元、足三里、三陰交等穴，諸穴共用，以抑制骨髓基質細胞的脂肪分化、促進成骨分化為突破口，從分子水平動態、系統地觀察這些指標在病變過程中的變化規律以及針刺干預的作用機制。

LPL 是脂肪細胞分化第一階段的標志基因，為了確定電針對BMSCs 成脂分化的影響，本研究以SD 大鼠為研究對象，采用卵巢切除法模擬絕經后骨質疏松癥模型，在體外對大鼠BMSCs 進行培養，觀察不同組別大鼠在成脂誘導培養后，其LPL-mRNA 的表達。結果顯示：雌激素組和電針組大鼠BMSCs 的LPLmRNA 的表達較模型組降低，說明雌激素和針刺治療均能在早期降低BMSCs 的成脂分化，由于成骨細胞與脂肪細胞存在著“此消彼長”的關系，因此可以間接反映電針可以促進絕經模型大鼠骨髓成骨細胞的增長，且骨密度檢查結果也提示電針治療能夠減輕大鼠去卵巢后骨量的丟失，因此抑制BMSCs 成脂分化，可能是電針治療骨質疏松癥的重要機制。