外源激素對杜仲愈傷組織中綠原酸含量的影響

雷燕妮，崔嬌嬌，張小斌

(1.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院,陜西 商洛 726000；2.商洛學院 健康管理學院, 陜西 商洛 726000)

杜仲屬杜仲科杜仲屬，又名絲綿木、絲連木、扯絲皮[1]，收錄于《中國珍稀瀕危保護植物名錄植物(第一冊)》[2]，并成為國家的二級保護植物。傳統醫學以杜仲的樹皮為藥，近幾十年國內外學者的大量研究表明杜仲葉和杜仲皮的化學成分基本一致,其中有效成分(如綠原酸)比杜仲皮中的含量要高，王亞琴[3]指出主要為木脂素類、環烯醚萜類、黃酮類、氨基酸、有機酸以及其他微量元素。當前查閱大多數文獻顯示杜仲對于人體肥胖、心腦血管疾病以及癌癥的治療都有一定的促進作用，其中比較顯著的是對于機體消化道疾病的治療；研究還發現杜仲的次生代謝產物綠原酸對腫瘤的治療和防御有著顯著的作用。因此杜仲逐漸被廣泛應用在醫療和保健品的生產上。杜仲為木本的植物，組織培養的難度比較大[4]，左春芬等[5]第一批進行杜仲組培的研究，將杜仲幼嫩的樹枝當外植體，對于愈傷組織有誘導作用，然而無法獲取再生的植株。1994年，夏啟忠與宋太偉等[6]人將杜仲實生苗的莖尖當作外植體，可以獲取杜仲再生的植株。在這之后，相應的報道逐漸呈現出來，杜仲組織培養技術開始進入初始發展階段。筆者研究用不同外源激素配比對商洛杜仲愈傷組織進行處理，探討影響綠原酸含量的最佳激素組合。以綠原酸含量為考察指標，通過高效液相色譜法測定，確定誘導杜仲愈傷組織形成的最佳外源激素和培養基，給杜仲離體的快速繁殖打下基礎。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

杜仲葉采于商洛市丹江公園，并經中國中醫研究院商洛GAP科研工程中心鑒定為杜仲科杜仲屬的葉子。

1.2 實驗試劑

色譜試劑(一級)選擇甲醇，水是純化水，色譜純乙腈，色譜純磷酸，其他試劑均為分析純。對照品選擇綠原酸，選自中國藥品生物制品的檢定所 ,供含量測定用)。所用MS培養基﹙BR，選擇上海宇涵生物科技有限公司，其批號為 )；2,4-二氯苯氧乙酸 (CP，上海試四赫維化工有限公司，批號:080414﹚6-芐氨基嘌呤﹙6-BA)(BR，上海伯奧生物科技有限公司，批號:080212)；萘乙酸(NAA，選自上海振企化學試劑有限公司，其批號為100415)。

1.3 實驗儀器

HPLC(Agilent 1200，配備四元泵，柱溫箱、VWD的檢測器與真空脫氣機)；數控超聲波清洗機(KQ-600DB)；電子天平(Sartorius，精確度0.0001 g)；過濾器(0.45 μm)；冷凍干燥系統。

2 實驗方法

2.1 培養基與培養條件

實驗中采用MS培養基，將PH調整為6.0,分裝后再在121℃,1.06 kg·cm-2的高壓滅菌鍋下滅菌20 min，在22±1℃條件下、光照強度為1 500～2 000 LX、一天進13 h的光照，形成愈傷組織，在20 d以后對誘導率進行統計，對愈傷組織的生長狀態進行觀察。

2.2 取材、消毒

實驗前，先將杜仲嫩葉用自來水沖洗2 h，之后選用洗衣粉進行浸泡處理，浸泡時長20 min，選用清水沖洗20 min后將其置于已滅菌處理的燒杯中，向里面加入75 %(V/V)的酒精進行殺菌處理，時長2 min，完成后選用無菌水進行沖洗，頻數3～4次，之后向里面加入0.1%wt的升汞溶液進行浸泡處理，時長為5 min，繼續重復無菌水沖洗步驟，結束之后，經無菌濾紙吸干水分，備用。

2.3 不同植物生長激素對愈傷組織的誘導效應

選用的生長調節劑有2,4-D、6-BA和NAA，實驗時選用的三種配方主要是上面三種。將植物的葉片作為外植體，經過上述殺菌消毒步驟處理后將其置于超凈工作臺上切割成相同大小的小塊(5 mm×5 mm)留待備用，每瓶中放入4塊切割好的小塊。進行30 d的接種之后，對愈傷組織的誘導率進行統計。

2.4 設計正交實驗

參照前人的單因素實驗基礎上，選擇影響愈傷組織中綠原酸的含量多少的三個主要激素：2,4-D、6-BA和NAA，并取各自的不同水平進行正交實驗。具體做法：準確稱取粉末9份，選擇不同濃度的2,4-D、6-BA和NAA為參試因子，以綠原酸的含量為衡量指標，增殖培養基的篩選采用L9實驗設計表布置實驗 。

表1 正交實驗的因素水平

2.5 色譜條件

HPLC色譜柱為HypersilC18-ODS柱(規格：250 mm×4.6 mm，5 μm)，其中乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)作為流動相；在327 nm條件下進行樣品的檢測；分別控制流速和柱溫為1.0 mL·min-1和25℃；一次性進樣量控制在10 μL，選用面積外標法測定含量。

2.6 對照品溶液的制備

對綠原酸的標準品進行精密稱取，稱取2.5 mg，放置在50 mL的容量瓶之中，選用甲醇溶解定容，溶液搖勻。此時得濃度為0.050 mg·mL-1標準綠原酸樣品，避光保存備用。

2.7 供試樣品溶液的制備

杜仲葉愈傷組織60 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，精密稱取杜仲愈傷組織各0.2 g置于10 mL容量瓶中，向里面加入9 mL 50%(V/V)的甲醇，將其置于超聲波清洗機中60 min進行提取處理，完成后提出將其置于室溫，搖勻，進行過濾操作。將濾液定容至10 mL容量瓶中，選用微孔濾膜對樣品進行過濾處理，此時即得目標溶液[7]。

2.8 方法學考察

2.8.1 線性關系考察 精密量取綠原酸0.050 mg·mL-1，作為對照液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，在10 mL的容量瓶之中經甲醇進行稀釋，稀釋到刻度，混勻。將已稀釋不同濃度的標準樣品溶液進行吸取，測定。橫坐標、縱坐標分別是綠原酸的濃度與峰面積，將標準曲線繪制完成。

2.8.2 精密度試驗 在同份對照品中準確吸取溶液，重復進樣，頻數為5次，每次10 μL，將其置于HPLC下進行測定并記錄下樣品的峰面積。

2.8.3 穩定性試驗 在同份對照品中準確吸取溶液，在0、2、8、16、20 h分別進樣，進樣量10 μL，記錄色譜峰面積。

2.8.4 重復性試驗 根據記錄供試品的溶液制備方式，在同等條件下制備5分樣液，進樣，每份樣品10 μL，并分別記錄色譜峰面積。

2.8.5 準確度考察 準確度的考察選用加樣回收實驗來驗證，精密稱取5份已經制備好的綠原酸樣品，每份樣品中加入 0.2 g，另做一對照性試驗，依照2.7的方法進行樣品溶液的制備，一次10 uL的進樣量，對色譜峰的面積進行記錄。

3 實驗結果與分析

3.1 愈傷組織中綠原酸含量的測定

3.1.1 系統適用性試驗 分別精密吸取對照品溶液、杜仲愈傷組織的同一供試品溶液進樣，測定。從圖1、圖2可見圖譜。

供試品中綠源酸色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，并與其他峰的分離度大于1.5，達到基線分離。

3.1.2 線性關系 精密量取50 μg·mL-1L的綠原酸對照液1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL，在10 mL的容量瓶之中經甲醇進行稀釋，稀釋到刻度，混勻，將液相色譜儀注入，濃度與峰面積的比值見圖3。

由圖3可以得出，綠原酸回歸方程為：Y=35765X-21065，R2=0.9992。結果表明綠原酸在5.0～50.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

3.1.3 精密度試驗 精密稱取10 μL濃度為50 μg·mL-1的綠原酸對照品溶液，重復五次，按照色譜條件優化結果進行檢測，測得結果為表2。

圖1 對照品HPLC色譜

圖2 供試品HPLC色譜

圖3 標準曲線

由表2可看出，綠原酸平均峰面積積分值為1808127.2，RSD為0.25%，精密度良好。

3.1.4 穩定性試驗 在同份對照品中準確吸取溶液，在0、2、8、16、20 h分別進樣，進樣量10 μL，記錄色譜峰面積，測得結果如表3所示。

由表3的數據分析出，綠原酸的平均峰面積值為1708001.3，RSD為1.9%。表明供試品溶液穩定。

3.1.5 重現性試驗 依照2.7中溶液的制備方法制備五份樣品，每一份樣品選10 μL進樣檢測，記錄色譜峰面積。結果如表4所示。

由表4可以得到，綠原酸的含量平均值1.25 mg·L-1，RSD%為1.8%。該結果顯示選用本方法有著良好的重現性。

3.1.6 加樣回收率試驗結果 選擇加樣回收實驗，對綠原酸含量0.2 g樣品稱取，重復稱取五次，向里面加入一定量的綠原酸對照品進行樣品溶液的制備。一次10 uL的進樣量，對色譜峰的面積進行記錄。結果見表5。

由表5可見，經高效液相色譜方法分析綠原酸的含量，得出回收率平均值98.23%，而相對標準的偏差是1.11%，說明系統有較好的回收率，穩定性較強。

3.1.7 正交試驗設計結果 將選用的供試品按順序進行編號之后，依照相對應的制備方法進行制備處理。依次精密量取不同編號的樣品溶液10 μL，依據色譜條件的優化結果測定進樣，測得結果見表6。

表2 精密度試驗結果(n=5)

表3 穩定性試驗結果(n=5)

表4 重現性試驗結果(n=5)

表5 加樣回收試驗結果(n=5)

極差分析 以綠原酸作為指標時，影響因素的大小順序為：B>C>A。則對綠原酸含量影響的激素作用為：2,4-D>6-BA>NAA。

從表6看出最佳培養基激素的條件為A3B3C2，即6-BA的濃度為1 mg·L-1，2,4-D的濃度1.0 mg·L-1，NAA的濃度為0.5 mg·L-1。在MS培養基中，激素為濃度為1 mg·L-1的6-BA、1 mg·L-1的2,4-D、0.5 mg·L-1的NAA時，將得到綠原酸的最高含量為1.58 mg·g-1。

實驗研究查閱了大量相關文獻，采用正交實驗分析法對三種激素的種類及其濃度進行篩選，此次試驗經HPLC法對愈傷組織之中的綠原酸含量進行測定，同時實施加樣回收的試驗、系統適用性的試驗與精密度試驗等，使實驗數據更為準確。

4 結論和討論

研究采用MS培養基對杜仲愈傷組織進行培養，經高效液相色譜方法對杜仲愈傷組織之中的綠原酸含量進行測定。測得綠原酸含量在0.05～0.5 mg·L-1范圍內具有良好線性關系(Y=35765X-21065，r=0.9992)。正交試驗結果表明：影響杜仲愈傷組織的誘導順序：綜合分析杜仲葉片誘導愈傷組織最佳培養基為:MS +1 mg·L-1·2,4-D + 1 mg·L-1·6-BA + 0. 5 mg·NAA，在外源激素濃度1.0 mg·L-1的6-BA、1.0mg·L-1的2,4-D、0.5 mg·L-1的NAA時，測定愈傷組織中綠原酸的含量，測得最高的綠原酸的含量達到1.58 mg·g-1。

表6 正交實驗設計(L9正交設計)

注：K為綠原酸的計算值；R為綠原酸的極差值。

表7 綠原酸條件優化結果