基于網絡藥理學的葛根治療冠心病作用機制研究

李冰濤 章輝 肖思雨 翟興英 涂珺 張啟云 徐國良 邵峰 朱衛豐 劉榮華

摘要：目的? 基于網絡藥理學方法探究葛根治療冠心病的作用機制。方法? 通過化學專業數據庫收集葛根化學成分并對其進行類藥性分析，預測作用靶點，構建成分-靶點網絡;通過CooLGeN檢索疾病相關基因，與葛根作用靶點做交叉分析，發現葛根治療靶點，并進行蛋白質相互作用網絡分析;最后進行GO生物學過程富集分析、通路富集分析。結果? 葛根的成分-靶點網絡包含70個成分、180個相應靶點，其中18個靶點為葛根治療冠心病的靶點。主要生物過程包括氮和氧的代謝與合成及脂肪酸代謝，主要通路包括血小板活化通路、花生四烯酸代謝通路、AGE/RAGE通路、一氧化氮作用通路等。結論? 葛根通過多靶點、多通路發揮對冠心病的治療作用，一氧化氮作用通路、AGE/RGAE通路、花生四烯酸通路等可能是葛根治療冠心病的主要通路。

關鍵詞：葛根;冠心病;網絡藥理學;生物過程;通路分析

中圖分類號：R259.414;R285??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0096-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.021????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To study the molecular mechanism of coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix based on network pharmacology. Methods Chemical components of Puerariae Lobatae Radix were collected through chemical professional database and the drug-like properties were analyzed; the targets were predicted; a component-target network was constructed. Disease-related genes were retrieved by CooLGeN and were cross-analyzed with the targets of Puerariae Lobatae Radix; the therapeutic targets of Puerariae Lobatae Radix were found; protein interaction network analysis was performed. Finally， the enrichment analysis of GO biological process and pathway enrichment analysis were carried out. Results Component-target network of Puerariae Lobatae Radix contained 70 components and 180 corresponding targets， of which 18 targets were targets for the treatment of coronary heart disease. The main biological processes included the metabolism and synthesis of nitrogen and oxygen and fatty acid metabolism. The main pathways included platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， AGE/RAGE pathway， and nitric oxide pathway. Conclusion The therapeutic effect of Puerariae Lobatae Radix on coronary disease may be realized through a multi-targets and multi-pathways way， and platelet activation pathway， arachidonic acid metabolic pathway， and AGE/RAGE pathway may play an important role in coronary disease treated by Puerariae Lobatae Radix.

Keywords： Puerariae Lobatae Radix; coronary disease; network pharmacology; biology process; pathway analysis

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化所致的管腔狹窄，冠狀動脈供血相對不足，引起心肌缺血、缺氧的心臟疾病[1]，屬中醫學“胸痹”“心悸”范疇。《金匱要略》認為胸痹的病機為“陽微陰弦”。心氣不足，痰瘀互結，心氣虛無力推動血液在脈道中運行，則血行瘀滯而瘀阻心脈[2]。葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，性涼，味甘、辛，歸脾、胃、肺經[3]。《神農本草經》記載葛根“主諸痹”，即可用于氣血痹阻不通之證。由于葛根成分復雜，且冠心病的發生發展涉及機體調控網絡中多個基因和信號通路，單靶點、單藥物的研究方法不適合系統說明葛根治療冠心病的機制。因此，本研究基于網絡藥理學，通過對葛根藥物-靶點-生物過程-途徑的復雜網絡關系研究，從多成分、多通路作用角度闡述葛根治療冠心病的作用機制。

1? 資料與方法

1.1? 化學成分收集

基于化學專業數據庫（http：//www.organchem. csdb.cn）收集野葛化學成分，檢索日期為2018年8月1日。除去金屬元素與結構正在更新的化學成分，通過PubMed Compound（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed）與Chemicalbook數據庫（https：//www. chemicalbook.com/）確認分子結構，下載并保存為sdf或mol格式文件，建立葛根成分數據庫。

1.2? 類藥性分析

化學成分通過吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程才能發揮藥效。藥物的吸收是藥物成藥的基礎，類藥性分析是評價吸收特性的基礎分析方法。根據Lipinski規則，當氫鍵供體數目（連接在N和O上的氫原子數）>5、氫鍵受體數目（N和O的數目）>10、相對分子質量>500、脂水分配系數ClogP>5或MlogP>4.15、化合物中可旋轉鍵的數量超過10個時，吸收或滲透效果較差的可能性更大[4]。利用SYBYL2.0軟件設計分子表單，計算相應參數，以違背該規則2項以上為排除標準，從葛根成分數據庫中篩選活性成分。

1.3? 藥物靶點預測

1.3.1? 葛根成分-靶點網絡

基于Swiss target prediction數據庫（http：//www. swisstargetprediction.ch/），依據分子SMILES號查找相應靶點，將其下載為csv格式并整理。為提高預測靶點的質量，本研究以與葛根小分子交互作用概率>50%（Probability>0.5）的靶點作為有效靶點。利用Cytoscape3.2.1軟件建立可視化成分-靶點網絡。在該網絡中，各化合物與對應的靶點進行關聯，節點代表蛋白或化合物，線代表蛋白與化合物的相關性[5]。

1.3.2? 藥物-疾病共同靶點分析

CooLGeN是在線文本挖掘工具，通過關鍵詞檢索檢索可以發現關鍵詞相關的基因。本研究基于CooLGeN（http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php）收集疾病靶點，通過與葛根作用靶點交叉分析，得到葛根治療冠心病的可能作用靶點。為保證檢索疾病靶點的有效性，避免假陽性，研究過程中依據文獻影響因子和靶點基因頻率刪除部分文獻影響因子低且支持數據較少的靶點基因。具體方法為：以冠心病的醫學主題詞“Coronary disease”為檢索詞，文獻影響因子（impact factor）為5～40，出版年限（publishing year）為1988～2018，靶點基因類型（input genes）為All human genes，基于文獻檢索冠心病的相關靶點基因，篩選基因頻率最高的80%基因為疾病基因。最后將葛根成分靶點與冠心病靶點導入Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行分析。

1.3.3? 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建

藥物對疾病的治療效應是多個蛋白交互作用的結果。本研究使用在線交互作用工具GeneMANIA（http：//genemania.org/）構建葛根治療冠心病的交互作用網絡。首先將葛根治療冠心病的可能作用蛋白轉化為基因名，導入GeneMANIA，物種選擇為人（Homo sapions），構建蛋白質交互作用關系，然后將蛋白質交互關系以csv格式文件導入Cytoscape3.2.1，可視化蛋白質交互作用網絡，分析網絡節點特征（Degree）找出葛根治療冠心病的重要靶點。

1.3.4? 生物學過程與通路富集分析

將葛根治療冠心病交互作用蛋白導入ClueGO插件，分別進行生物學過程（biology process）富集分析和通路（pathway）富集分析。通路富集分析數據庫選擇KEGG和wikipathway數據庫，P≥0.05，其余參數均為默認值。

2? 結果

2.1? 葛根化學成分及類藥性分析

通過對下載成分結構進行確認，共得到葛根成分100個，主要為黃酮類成分。其中94個成分符合Linpinski類藥性原則，編號為M1～M94，見表1。

2.2? 葛根成分-靶點作用網絡構建

葛根94個成分中，24個成分無有效靶點，其余70個成分共作用于180個靶點，依據其對應關系構建成分-靶點網絡（見圖1）。可見，1種成分可作用于多個靶點，1個靶點也聯系著多種成分，體現了葛根多靶點、多通路的作用特點。

2.3? 葛根治療冠心病的作用靶點分析

基于CooLGeN檢索得到冠心病相關基因508個。對冠心病相關基因及葛根作用靶點基因名稱進行交叉分析，比對冠心病及葛根共同基因18個，分別為NOS3、NOS1、NOS2、ALPP、MPO、CDK1、MMP2、MMP3、ESR1、CYP19A1、FABP4、PTGS1、PTGS2、ALDH2、LDLR、MIF、TERT、CYP1A1。這些基因可能是葛根治療冠心病的作用靶點。

2.4? 靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析

將葛根治療冠心病的18個可能作用靶點以基因名稱導入GenMANIA，發現20個蛋白與葛根治療冠心病的靶點有交互作用，基于葛根作用靶點及交互作用的38個蛋白構建的蛋白質交互作用網絡見圖2。可以看出，在葛根治療冠心病蛋白質交互作用網絡中，Degree值較高的前5個節點依次為CYP119A1（31）、NOS1（29）、CYP11A1（26）、NOS3（25）、NOS2（24），這些節點蛋白可能在葛根治療冠心病作用的過程中發揮重要作用。

2.5? 生物學過程富集分析

對蛋白質交互作用網絡中的38個基因進行生物學過程富集分析，共獲得89條生物過程。以P<0.01為條件，前20條生物通路的注釋信息見表2。結果顯示，葛根治療冠心病的生物學過程主要為cGMP生物合成過程的正向調控、活性氧代謝過程、cGMP代謝過程的正向調節、cGMP生物合成過程、cGMP生物合成過程的調控、cGMP代謝過程、一氧化氮代謝過程、活性氮代謝過程、活性氧生物合成過程、一氧化氮生物合成過程、甾醇代謝過程、核苷酸代謝過程的正向調節、嘌呤核苷酸代謝過程的正向調節、長鏈脂肪酸代謝過程等。

2.6? 通路富集分析

對葛根治療冠心病交作用靶點進行通路富集分析，共獲得32條通路，其中18條通路來源于KEGG數據庫，14條通路來源于Wiki Pathways數據庫，見圖3。這些通路包括花生四烯酸代謝通路、血小板活化通路、一氧化氮作用通路、AGE/RAGE通路、精氨酸生物合成通路、精氨酸與脯氨酸代謝通路、NF-κB信號通路、脂肪酸ω氧化通路、醛固酮合成與分泌通路、脂肪細胞脂解作用調節通路、前列腺素的合成與調控通路、雌激素受體通路、硫胺素代謝通路、葉酸生物合成通路、腎素分泌通路、唾液分泌通路、甾體激素生物合成通路、色氨酸代謝通路、細胞色素P450對外源化合物代謝影響、卵巢類固醇生成通路、維生素B12代謝通路、葉酸代謝通路、細胞色素P450氧化通路等。

3? 討論

網絡藥理學是從整體角度認識藥物與機體的相互作用，這種現代生物醫藥研究的哲學理念和研究模式與中醫整體觀念不謀而合，為中醫藥現代化研究提供了新的思路。探索中藥治療疾病的作用機制是網絡藥理學在中醫藥研究中的主要應用領域。

本研究運用網絡藥理學方法探索葛根治療冠心病的機制。通過葛根治療冠心病的物質基礎，構建其治療冠心病的蛋白質相互作用網絡，并富集了該生物學過程和代謝通路。結果顯示，葛根治療冠心病可能與cGMP、一氧化氮的生物合成、代謝，活性氧的生成，花生四烯酸代謝及脂肪酸氧化等相關，這些生物過程與葛根擴張血管、降脂、抗炎、抗氧化等藥理作用一致。代謝通路中氨基酸、激素、酯類代謝和一氧化氮的作用通路等都與冠心病有關。精氨酸與脯氨酸代謝通路在冠心病心血瘀阻證的亞血瘀證期發揮了重要作用[6]。花生四烯酸代謝也與冠心病密切相關，血栓素A2和前列環素作為花生四烯酸代謝產物，二者之間的平衡失調會導致冠心病進一步發展，甚至發生心肌梗死[7]。另外，AGE/RAGE通路與冠心病的發生也有著一定的關系，晚期糖基化終末產物（AGEs）在動脈管壁中巨噬細胞和平滑肌細胞內外的沉積，與動脈粥樣硬化病變嚴重程度有關。AGEs與晚期糖基化終末產物受體（RAGE）結合會激活核因子-κB，分泌大量致炎性因子，造成血管內皮損傷，加速動脈粥樣硬化斑塊發展，體外實驗顯示葛根提取物能抑制AGEs形成[8-9]，AGE/RAGE通路可能是個葛根治療冠心病的重要通路。一氧化氮是一種信使分子，可舒張血管周圍的平滑肌細胞，使血管擴張，增加心肌供血供氧，改善冠心病患者心肌缺血缺氧狀態。臨床研究顯示，葛根主要成分葛根素能顯著升高冠心病患者一氧化氮水平，有效改善心肌缺血[10]。血栓形成學說是冠心病的主要發病學說，活化的血小板暴露的磷脂內膜可以促進凝血過程發生和發展。葛根治療冠心病與其血小板活化作用相關[11]。

本研究采用網絡藥理學方法初步研究葛根治療冠心病機制，研究結果顯示富集分析獲取的生物過程與藥理效應相符，相關代謝通路可能是葛根治療冠心病的機制。本研究結果可為后期實驗研究提供理論依據與參考。

參考文獻：

[1] 王永剛，齊婧，鐘偉，等.冠心病中醫病因病機的認識與探索[J].中醫雜志，2015，56（17）：1449-1452.

[2] 張苒，石磊.《金匱要略》“陽微陰弦”在冠心病心絞痛辨治中的指導意義[J].現代中西醫結合雜志，2009，18（27）：3288-3289.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：333.

[4] LIPINSKI C A， LOMBARDO F， DOMINY B W， et al. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings 1[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2012，64（1/2/3）：4-17.

[5] 潘國鳳，羅然，呂文英，等.基于網絡藥理學養陰清肺口服液對肺損傷的保護作用及機制研究[J].中藥藥理與臨床，2018，34（1）：19-24.

[6] 劉培，肖隋熙，羅穎，等.心血瘀阻證動態演變過程生物信息學研究[J].湖南中醫藥大學學報，2018，38（2）：130-135.

[7] 楊魯渤，李光明，張慶成，等.冠心病患者血漿花生四烯酸代謝產物的臨床研究[J].醫學綜述，1997，3（11）：542-543.

[8] 喬愛敏，李樂，劉青.晚期糖基化終產物及其受體RAGE在糖尿病血管并發癥中的作用機制[J].中國臨床藥理學與治療學，2014，19（11）：1306- 1311.

[9] KIM J M， LEE Y M， LEE G Y， et al. Constituents of the roots of Pueraria lobata inhibit formation of advanced glycation end products （AGEs）[J]. Archives of Pharmacal Research，2006，29（10）：821-825.

[10] 徐波，張玲.葛根素對冠心病患者血漿內皮素和一氧化氮水平及心肌缺血的療效探討[J].實用臨床醫藥雜志，2012，16（17）：37-39.

[11] 曾躍華，陳云龍.葛根素治療冠心病及對活化血小板的影響[J].長春中醫藥大學學報，2011，27（6）：997.

（收稿日期：2018-10-18）

（修回日期：2018-11-22;編輯：陳靜）