芍藥苷對腦缺血再灌注損傷大鼠NLRP3炎癥體信號通路相關因子表達的影響

劉湘 喬麗菲 劉垚君 鄭范麗 張玉琴 林羽

摘要：目的? 觀察芍藥苷對腦缺血再灌注損傷大鼠NLRP3炎癥體信號通路相關因子表達的影響，探討其神經保護作用機制。方法 ?SPF級雄性SD大鼠48只，隨機分為假手術組、模型組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷高劑量組，每組12只。采用線栓阻斷法制作大鼠腦缺血再灌注模型，缺血2 h后進行再灌注，再灌注后1 h腹腔注射芍藥苷（2.5、5 mg/kg），每日1次，連續7 d。Zea Longa 5分評價方法對大鼠進行神經功能評分。ELISA檢測大鼠血清白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α的含量。RT-PCR和Western blot分別檢測大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白的表達。結果? 與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠神經功能評分各時點均降低，芍藥苷低劑量組第7日和芍藥苷高劑量組第3、5、7日神經功能評分差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表達均上調;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低，大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1、NLRP3 mRNA和蛋白表達顯著下調（P<0.01）。結論? 芍藥苷對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經保護作用，其機制可能與抑制NLRP3炎癥體信號通路分子的表達、減輕炎癥反應相關。

關鍵詞：腦缺血再灌注損傷;芍藥苷;NLRP3;NLRP1;Caspase-1;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.010????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of paeoniflorin on cerebral ischemic-reperfusion injury through NLRP3 inflammatory signaling pathway; To explore its neuroprotective mechanism. Methods Totally 48 SPF male SD rats were randomly divided into four groups with 12 rats in each group： sham-operation group， cerebral ischemic-reperfusion group， paeoniflorin high- and low-dosage groups. Suture-occluded method was used to block middle cerebral artery and I/R model of SD rats was made. Paeoniflorin 2.5， 5 mg/kg （one time per day and for seven days） were administrated by intraperitoneal injection after 2 h ischemic and 1 h reperfusion. Zea Longa 5-point evaluation method was used for neurological impairment score in rats. Contents of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α were detected by ELISA. Western blot and RT-PCR were used to detect the protein and gene expressions of IL-1β， IL-6 and TNF-α， as well as Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 in brain tissue. Results Compared with the model group， the neurological scores of paeoniflorin high- and low-dosage groups decreased at different time points; there were statistical significance in the neurological scores on the 7th day of paeoniflorin low-dosage groups and the 3rd， 5th and 7th day of paeoniflorin high-dosage groups （P<0.05， P<0.01）. Compared with sham-operation group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in the model group increased， and the expressions of IL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1 and NLRP3 mRNA and protein were up-regulated in rat brain in the model group; compared with the model group， the levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in paeoniflorin high- and low-dosage groups significantly decreased， and IIL-1β， IL-6， TNF-α， Caspase-1， NLRP1， NLRP3 mRNA and protein expression in brain tissue were significantly down-regulated （P<0.01）. Conclusion Paeoniflorin has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats， and its mechanism may be related to inhibition of molecule expression of NLRP3 inflammatory signaling pathway， thereby reducing inflammation.

Keywords： cerebral ischemia-reperfusion injury; paeoniflorin; NLRP3; NLRP1; Caspase-1; rats

腦卒中具有發病率、病死率、致殘率和復發率高的特點，隨著人口步入老齡化社會，其發病率呈逐年上升趨勢。其中缺血性腦卒中約占腦卒中發病的80%，是一個涉及多種機制、多個階段、多種細胞各自及相互作用的過程[1]。芍藥苷是白芍中主要活性成分之一，具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗肝纖維化[4]、抗動脈粥樣硬化[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。近年來，芍藥苷在腦損傷方面的作用受到越來越多的關注。課題組前期研究發現，芍藥苷可通過抑制神經元凋亡、調控Ca2+/CaMKⅡ/CREB信號通路，發揮對腦缺血再灌注（ischemic-reperfusion，I/R）損傷的保護作用[7-8]。本研究建立腦I/R損傷大鼠模型，觀察芍藥苷對I/R損傷大鼠NLRP3炎癥體信號通路相關因子表達的影響，探討其神經保護作用機制，為臨床尋找治療新靶點提供依據。

1? 實驗材料

1.1? 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質量（260±20）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號SCXX（滬）2017-0005，動物質量合格證號2015000547928。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級醫學實驗動物房。

1.2? 藥物

芍藥苷，中國食品藥品檢定研究院提供，批號110736-201033。

1.3? 主要試劑與儀器

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher，K1622），Power SYBR? Green PCR Master Mix（Thermo Fisher，4367659），Caspase-1多克隆抗體（Abcam，ab1872），NLRP1多克隆抗體（Abcam，ab3683）;NLRP3多克隆抗體（Novusbio，NBP2-12446），β-actin抗體（Cell Signaling Technology，#4970），SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），HRP結合山羊抗兔 IgG、HRP結合兔抗鼠 IgG（廈門鷺隆生物科技有限公司）。實時熒光定量PCR儀（AppLied Biosystems，型號7900HT），凝膠成像分析系統（Bio-Rad，型號ChemiDoc XRS+），高速臺式冷凍離心機（ThermoFisher，型號PrimoR），線栓（廣州佳靈生物技術有限公司，型號3600）。

2? 實驗方法

2.1? 造模

將實驗大鼠隨機分為假手術組（12只）和造模組（36只），術前12 h禁食不禁水，次日根據前期造模方法[7-8]進行左側大腦中動脈阻塞手術。造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA），并結扎，分離頸內動脈（ICA），將線栓經CCA插入ICA至顱內大腦前動脈的近端（18～20 mm），停止插線以阻斷該側大腦中動脈血流，導致腦缺血，阻塞2 h后拔出線栓實現再灌注。假手術組除不插入線栓外其余操作同造模組。

2.2? 大鼠神經功能評分

術后24 h根據Zea Longa 5分評價方法[8]對腦I/R損傷大鼠進行神經功能損傷評價，將大鼠神經癥狀分為0～4分。0分：無神經功能缺損;1分：提尾時右前肢內收，不能完全伸展;2分：自發行走時向右側轉圈;3分：行走時身體向右側傾倒;4分：不能自發行走，有意識喪失。選擇評分為1～3分造模成功大鼠進行后續實驗。

2.3? 分組和給藥

將造模組大鼠分為模型組、芍藥苷低劑量組和芍藥苷高劑量組，每組12只。再灌注后1 h，芍藥苷低、高劑量組大鼠分別腹腔注射芍藥苷2.5、5 mg/（kg·d），假手術組和模型組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。給藥體積0.6 mL/100 g，每日1次，連續7 d。

2.4? ELISA檢測血清相關炎癥因子含量

末次給藥后，大鼠麻醉腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，收集上清液，根據ELISA試劑盒說明書步驟進行IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α含量檢測。

2.5? RT-PCR檢測腦組織相關炎癥因子mRNA表達

末次給藥后，大鼠麻醉取左側腦組織100 mg。Trizol法提取總RNA，檢測A260、A280，取A260/A280在1.8～2.0的樣品，計算總RNA濃度。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行反轉錄，各目的基因擴增引物序列見表1。實時定量PCR反應：50 ℃預熱2 min，95 ℃預熱10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環。采用ABI7900熒光定量PCR儀上軟件進行數據分析，計算目的基因相對表達量。

2.6? Western blot檢測大鼠腦組織Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達

末次給藥后，大鼠麻醉取左側腦組織100 mg，加入含1%PMSF裂解液1 mL，研磨，12 000×g離心10 min，取上清液，采用BCA法測樣品蛋白濃度，并計算30 μg樣品蛋白的體積。加入1/4體積5×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃變性7 min。常規12%SDS-PAGE分離，轉膜，封閉2 h，加入稀釋的一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，次日TBST洗3次×10 min，加入1∶5000稀釋HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次×10 min。加ECL顯色劑，經凝膠成像分析系統檢測，分析目標條帶的灰度值，以目標蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量，并分析組間差異。

3? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間差異用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 芍藥苷對模型大鼠神經功能損傷的影響

模型組大鼠術后3 d神經功能損傷情況逐漸加重，神經功能評分較假手術組顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低劑量組第1、3、5日和芍藥苷高劑量組第1日大鼠神經功能評分差異無統計學意義，芍藥苷低劑量組第7日和芍藥苷高劑量組第3、5、7日大鼠神經功能評分顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見圖1。

4.2? 芍藥苷對模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見圖2。

4.3? 芍藥苷對模型大鼠腦組織相關因子mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA表達均降低，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖3。

4.4? 芍藥苷對模型大鼠腦組織相關因子蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，芍藥苷低、高劑量組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-1、NLRP1和NLRP3蛋白表達均降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4、圖5。

5? 討論

近年研究顯示，神經元和膠質細胞內NLRP1和NLRP3炎癥小體可能在缺血性腦中風的細胞損傷方面和炎癥反應調節中扮演著重要角色[9-11]。I/R損傷涉及多種因素相互作用的炎癥級聯反應過程，在此過程中，NLRP3炎癥小體被激活，隨后釋放Caspase-1、IL-1β等炎性物質，持續作用于損傷組織，加重組織的損傷[9]。所以，抑制或阻斷NLRP3炎性體的激活可能為I/R損傷所引起的炎癥提供新的治療策略。在缺血性腦中風發生后，NLRP3或NLRP1蛋白與Caspase-1前體和ASC等結合形成多蛋白復合物NLRP3或NLRP1炎癥小體，炎癥小體形成后，Caspase-1前體通過自身催化作用被激活，激活后的Caspase-1可剪切IL-1β和IL-18的前體，使之形成具有活性的成熟形式并隨即釋放進胞外環境與細胞膜上相應受體結合，介導下游MAPK和核因子-κB通路，從而誘導神經元增殖、凋亡[12-13]。

本研究結果表明，低劑量芍藥苷可顯著降低大鼠第7日神經評分，高劑量芍藥苷可顯著降低大鼠第3、5、7日神經評分，改善神經功能損傷，驗證了芍藥苷對腦I/R損傷大鼠的保護作用。此外，本研究還發現，芍藥苷可明顯降低大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量。被激活后的NLRP3炎性體可促進Caspase-1表達，并進一步導致IL-1β、IL-6、TNF-α等與炎癥級聯反應有關的細胞因子的活化[14]。

綜上所述，芍藥苷能有效抑制腦I/R損傷后缺血腦組織Caspase-1、NLRP1和NLRP3 mRNA和蛋白表達，并能降低NLRP3炎癥體信號通路下游的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，提示芍藥苷可抑制NLRP3信號通路的激活，從而減輕腦I/R損傷。

參考文獻：

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