響應面法優化提取丁香中的總黃酮及抗氧化性研究

張玲玲,孫芬芳,張蓉希，王建化

(青島農業大學 海都學院，山東 萊陽 265200)

丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，是重要的食用香辛調料。丁香性味辛、溫，具有溫中降逆、散寒止痛、補腎助陽的功效，也是重要的中藥材[1]。丁香中含有丁香酚、丁香油、黃酮等活性成分，是丁香應用于調味食品及藥用的主要物質[2,3]。有研究表明[4-8]，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，能有效阻止人體脂質的自氧化反應，及時清除體內過量的自由基，延緩人體衰老。因此，黃酮類化合物的提取與抗氧化性的研究受到人們的廣泛關注。目前，李利華[9]研究正交實驗法優選丁香總黃酮的提取工藝，李育博等[10]研究響應面法優化提取野生南果梨果肉中黃酮，劉蕓等[11]研究響應面酶法輔助超聲提取芫荽總黃酮的工藝，王俊青等[12]研究響應面法優化南方紅豆杉葉總黃酮提取工藝，而用響應面法優化丁香中總黃酮的提取工藝及抗氧化性研究較少。因此，本研究利用超聲波輔助提取丁香中的總黃酮，通過響應面試驗得到最佳提取條件，然后對其抗氧化性進行研究，以期提高對丁香總黃酮的進一步開發與利用價值，為丁香的應用提供了理論依據。

1材料與方法

1.1 實驗材料

蘆丁標準品：優級純，購自博美生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, ≥97.0%)：購自福州飛凈生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等：均為分析純，購自國藥集團有限公司；丁香：市售。

SB25-12DTN型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；CP114型分析天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

取丁香，干燥，粉碎，過40目篩，備用。

1.2.2 標準溶液的配制

精密稱取烘干至恒重的蘆丁標準品5 mg，加入濃度為60%的乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.2.3 標準曲線的繪制

分別移取上述蘆丁標準溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 10%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，然后加4 mL的4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。10 min后，在510 nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，蘆丁濃度(c)為橫坐標，繪制標準曲線，所得回歸方程為A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

1.2.4 丁香總黃酮含量的測定

參照文獻[9]的方法，根據標準工作曲線，測得總黃酮含量，按照下式計算總黃酮的提取率，每個樣品做3次平行實驗。

式中：c為測得的總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為稀釋倍數，m為丁香粉總質量，g。

1.2.5 單因素試驗設計

1.2.5.1 乙醇濃度對丁香總黃酮提取率的影響

準確稱取5份質量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入25 mL濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，設置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時間為40 min，抽濾得浸提液。按1.2.4步驟測定總黃酮的含量，計算總黃酮的提取率，討論不同乙醇濃度對丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.2 液料比對丁香總黃酮提取率的影響

準確稱取5份質量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別按照液料比15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1加入60%的乙醇溶液，設置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時間為40 min。按1.2.4步驟測定總黃酮的含量，計算總黃酮的提取率，討論不同液料比對丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.3 提取時間對丁香總黃酮提取率的影響

準確稱取5份質量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入45 mL 60%的乙醇溶液，設置超聲提取溫度為40 ℃，超聲提取時間分別為30，40，50，60，70 min。按1.2.4步驟測定總黃酮的含量，計算總黃酮的提取率，討論不同提取時間對丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.5.4 提取溫度對丁香總黃酮提取率的影響

準確稱取5份質量為1 g的丁香粉末于具塞錐形瓶中，分別加入45 mL 60%的乙醇溶液，然后將5個具塞錐形瓶置于超聲波清洗機中超聲，設置超聲提取時間為60 min，超聲提取溫度分別為40，45，50，55，60 ℃。按1.2.4步驟測定總黃酮的含量，計算總黃酮的提取率，討論不同提取溫度對丁香總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應面試驗設計

根據以上的單因素試驗結果，依據Box-Benhnken試驗設計原理，以總黃酮的提取率為響應值，在乙醇濃度、液料比、提取時間3個單因素的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，各因素和水平設計見表1。

表1 響應面設計因素及水平表

1.2.7 DPPH自由基清除活性

參考馬莎莎等的測定方法并略作改動。準確稱取適量 DPPH 粉末用乙醇溶解并定容，配制成0.071 mmol/L的DPPH 溶液。取1 mL不同濃度的樣品提取液及0.071 mmol/L的DPPH 溶液4 mL，用乙醇定容至10 mL，室溫下暗處反應30 min，在517 nm處測定吸光度。以相應濃度的Vc做對照，計算樣品的DPPH 自由基清除率。

式中：A0為未加樣的DPPH的吸光度；Ai為待測樣品與DPPH反應后的吸光度;Aj為未加DPPH的樣品溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對丁香總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇濃度對丁香總黃酮提取率的影響

由圖1可知，乙醇濃度為30%～60%，總黃酮的提取率穩步上升，并在乙醇濃度為60%時達到最高，分析原因可能是總黃酮在乙醇中的溶解度隨乙醇濃度上升而上升。乙醇濃度為60%～80%，總黃酮的提取率慢慢下降，分析原因可能是乙醇濃度過高使丁香中的部分其他物質析出增加，影響黃酮類化合物的溶出。因此，從總黃酮的提取率考慮，選取乙醇的濃度為60%。

2.1.2 液料比對丁香總黃酮提取率的影響

圖2 液料比對丁香總黃酮提取率的影響

由圖2可知，液料比(mL/g)在15∶1～45∶1，總黃酮的提取率一直保持快速上升狀態，分析原因可能是增大溶劑量，加大接觸面積，促進丁香中總黃酮的有效浸提。在液料比超過45∶1 (mL/g)以后，提取率逐漸下降，分析原因可能是液料比為45∶1 (mL/g)，丁香中的總黃酮已基本溶出，繼續增大液料比，可能會有部分物質溶出并阻礙了總黃酮的析出。因此，從總黃酮的提取率考慮，選取液料比為45∶1 (mL/g)。

2.1.3 提取時間對丁香總黃酮提取率的影響

圖3 提取時間對丁香總黃酮提取率的影響

由圖3可知，提取時間在30～60 min，提取率一直保持上升，60 min以后提取率慢慢下降，分析原因可能是在提取時間60 min以內，丁香與乙醇充分接觸，接觸時間越長，總黃酮溶出量越多，到60 min時總黃酮已基本溶出。提取時間超過60 min，隨著時間的延長，部分黃酮化合物發生了分解或者降解[13]。因此，從總黃酮的提取率和穩定性考慮，選取最佳提取時間為60 min。

2.1.4 提取溫度對丁香總黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對丁香總黃酮提取率的影響

由圖4可知，提取溫度對丁香中總黃酮提取率的影響比其他因素略小。提取溫度由40 ℃上升到50 ℃，提取率緩慢上升，提取溫度由50 ℃上升到60 ℃，提取率緩慢下降。分析原因可能是提取溫度在50 ℃以內，溫度升高，加快了丁香中分子的運動速率，總黃酮的溶出量增加。提取溫度超過50 ℃，隨著溫度的上升，使浸提液中部分成分與總黃酮發生了反應，減少了有效成分[14]。因此，從總黃酮的提取率和穩定性考慮，選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.2 響應面分析及試驗結果

響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計及數據處理

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表2中數據進行多元回歸方程擬合，得到丁香總黃酮提取率(Y)對自變量液料比(A)、提取時間(B)和乙醇濃度(C)的二次多項回歸方程：

Y=+12.12+0.31A+0.25B+0.33C-0.34AB-0.067AC+0.31BC-1.34A2-1.52B2-1.86C2。

表3 回歸方程方差分析表

注：“*”表示P<0.05，顯著；“**”表示P<0.01，極顯著。

由表3可知，模型的P<0.0001，顯示模型極顯著，此模型中失擬性不顯著(P>0.05)，表示此模型設計的預測值與實際值相近，有良好的線性關系，根據此模型可以得到丁香中總黃酮提取的最優工藝。由表3中F值可知，各因素對丁香總黃酮提取率的影響因素大小順序是：C(乙醇濃度)>A(液料比)>B(提取時間)。其中，一次項A，C、二次項A2、B2、C2對試驗結果的影響極顯著(P<0.01)，一次項B、交互項AB、BC對試驗結果的影響顯著。

通過Design-Expert V8.0.6軟件，輸入試驗結果可得到圖5的響應曲面圖。

圖5 兩因素間的交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖

圖5非常直觀地表現了液料比與乙醇濃度、液料比與提取時間、乙醇濃度與提取時間兩兩因素間的交互作用。響應曲面圖中圖形陡峭程度越小代表相互作用越小，反之則越大[15]。由圖5可知，兩兩因素間均有一定的交互作用，其中AB和BC的交互作用更顯著，這與表3中的顯著性結果一致。

2.3 總黃酮最佳提取工藝條件的驗證

通過Box-Behnken試驗設計，得到超聲提取丁香總黃酮的最佳工藝條件為：液料比46.04∶1(mL/g)，提取時間60.80 min，乙醇濃度60.92%，在該條件下總黃酮的理論提取率是12.16%，為方便驗證該方法的可行性，采用上述條件的調整值：液料比46∶1(mL/g)，提取時間61 min，乙醇濃度61%，對丁香中的總黃酮進行提取。結果表明：超聲輔助提取丁香中的總黃酮平均提取收率(n=3)為12.11%，RSD=0.38%。結果與軟件分析得到的理論值相近，證明試驗模型選擇可靠，此提取工藝可行。

2.4 DPPH自由基清除活性

按以上提取工藝條件提取丁香中的總黃酮，配制不同濃度的溶液，按1.2.7試驗方法研究總黃酮的抗氧化性。丁香總黃酮和Vc的DPPH自由基清除率結果見圖6。

圖6 丁香總黃酮DPPH自由基清除效果

由圖6可知，丁香總黃酮和Vc對DPPH自由基都具有明顯的清除效果，且隨著濃度升高而逐漸增加。在試樣濃度小于0.3mg/mL時，Vc的清除率明顯大于丁香總黃酮的清除率。當試樣濃度大于0.3mg/mL時，丁香總黃酮與Vc的清除率越來越接近，丁香總黃酮的清除率達到90%以上，這與黃晶玲等的研究結果一致。

3 結論

本文采用超聲波輔助提取法從丁香中提取總黃酮，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，測定總黃酮標準曲線為： A=7.8749c+0.02792(R2=0.995)。

通過響應面試驗設計優化丁香總黃酮的提取工藝，以總黃酮的提取率作為考核標準，得到最佳條件為乙醇濃度61%，液料比46∶1(mL/g)，超聲提取時間61 min，超聲提取溫度50 ℃。該方法簡單快速，提取率高，為丁香中總黃酮的應用前景提供了保障。

DPPH自由基清除試驗表明，丁香總黃酮對DPPH自由基具有明顯的清除效果，且隨著濃度升高而逐漸增加。丁香總黃酮的濃度大于0.3 mg/L時，清除率達到90%以上。