固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海產(chǎn)品中谷氨酸鈉的含量

張曉瑜，張桂芳，王志昱，張藝，董桂賢

(煙臺市疾病預(yù)防控制中心，山東 煙臺 264003)

鮮味是人們飲食中不可缺少的美味之一。我國將多種化合物的綜合味感均定義為鮮味[1]，其中L-谷氨酸鈉(以下稱為谷氨酸鈉)作為最主要的鮮味調(diào)味品，價(jià)格低廉，不僅在日常的餐飲中被大量使用，而且在食品加工行業(yè)中也被廣泛應(yīng)用[2]。雖然多國研究提出，正常攝入量的谷氨酸鈉對人體相對安全[3-6]，但在2017年，歐盟一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸對大鼠造成不良效應(yīng)的攝入量為每公斤體重3.2 g，在此基礎(chǔ)上制定了谷氨酸及其鹽類的ADI為每天30 mg/kg·BW[7],目前我國尚缺少谷氨酸鈉日常攝入量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。素有“海鮮”之稱的海產(chǎn)品，雖然含有豐富多樣的自然鮮味物質(zhì)[8]，但其鮮味會因儲存不當(dāng)而流失或被產(chǎn)生的異味掩蓋。所以，海產(chǎn)品在加工過程中會添加大量的谷氨酸鈉以增加風(fēng)味、掩蓋異味。精加工海產(chǎn)品作為谷氨酸鈉添加量較大的一類食品，其安全性已引起社會關(guān)注。

食品中谷氨酸鈉的主要檢驗(yàn)方法有高氯酸非水溶液滴定法、旋光法、酸度計(jì)法[9]，上述方法只適用于味精產(chǎn)品中谷氨酸鈉含量的檢測，但不適用于基質(zhì)復(fù)雜的食品樣品。且目前尚無食品樣本中谷氨酸鈉含量測定的國家標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范性檢測方法[10]。本方法針對海產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)，建立一種操作簡單、高效靈敏、準(zhǔn)確可靠的檢測方法，采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，應(yīng)用于對本地區(qū)40份海產(chǎn)品中谷氨酸鈉含量的檢測，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 1260-G6460高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源 ESI) 美國Agilent公司；OA-sys氮吹儀 美國Organomation公司；SUP-100固相萃取儀 美國Supelco公司；均質(zhì)器、高速冷凍離心機(jī)、渦旋混勻器、電子天平等。

1.1.2 主要試劑及耗材

乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純，德國默克公司)、氨水(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、MAX混合型離子交換固相萃取柱(CNW公司)、L-谷氨酸鈉鹽(純度>99.9%，美國Cato公司)等。試驗(yàn)用水均為一級。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

美國安捷倫PFP色譜柱(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，采用梯度洗脫方式，流動相分別為A：0.2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸/水，B：0.2%甲酸/乙腈，梯度洗脫程序見表1。流量為0.20 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為40 ℃，谷氨酸鈉保留時(shí)間為1.116 min。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度300 ℃，離子噴霧電壓4500 V，霧化氣流速氮?dú)?.0 mL/min，噴霧器壓力45 PSI，脫溶劑氣流速：氮?dú)?1.0 mL/min，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，谷氨酸(鹽)定性定量離子對：m/z 148.0～84.1， m/z 148.0～56.1，碰撞能分別為13，25 eV。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

樣品分別置于均質(zhì)器中粉碎10 min。稱取1.0 g粉碎樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L 鹽酸水溶液，渦旋2 min，冷凍離心5 min，取1 mL上清液，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾后，并用0.1 mol/L 鹽酸水溶液沖洗濾紙，合并沖洗液定容至100 mL。按照樣品中谷氨酸鈉的含量用0.1 mol/L 鹽酸水溶液進(jìn)行稀釋(依據(jù)2.2中的稀釋方法)，然后取1 mL溶液待凈化。以1 mL 5% 氨水活化MAX柱并抽干，1 mL待凈化溶液加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中和后，將2 mL中和液上樣，以0.5 mL純水淋洗2次，0.5 mL甲醇淋洗2次后，棄去淋洗液。用1 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫2次，合并洗脫液，氮?dú)獯蹈珊螅? mL初始流動相復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理?xiàng)l件選擇

海產(chǎn)品種類較多，基質(zhì)含量復(fù)雜，含有大量鹽類、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等，對樣品前處理要求較高。本研究分別以40份勻漿后的新鮮海產(chǎn)品和人工添加谷氨酸鈉的精加工海產(chǎn)品為研究對象，分別考察了鹽酸水溶液、鹽酸甲醇溶液、鹽酸乙腈溶液的提取效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸水溶液回收率較高，滿足樣本測定要求；溶解脂肪等雜質(zhì)較少，容易過濾。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol/L鹽酸水溶液作為提取溶劑較為適宜。

2.2 MAX柱對谷氨酸鈉的載量與優(yōu)化

提取后的溶液中除谷氨酸鈉外還溶解了大量的雜質(zhì)，故選擇吸附-解吸原理的MAX固相萃取柱。但海產(chǎn)品特別是精加工海產(chǎn)品中谷氨酸鈉含量過高，在實(shí)驗(yàn)過程中，MAX固相萃取柱容易過載，因此分別采用不同的加標(biāo)濃度對MAX柱萃取回收率進(jìn)行驗(yàn)證，回收率試驗(yàn)見表2。故應(yīng)將上柱前谷氨酸鈉配制在500 ng以下較為理想。根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，未添加谷氨酸鈉的散裝新鮮海產(chǎn)品的稀釋倍數(shù)為1000～2000倍較為理想，人工添加谷氨酸鈉的精加工海產(chǎn)品的稀釋倍數(shù)可采用5000～10000倍。儀器測定超過500 μg/L結(jié)果時(shí)需要加大稀釋倍數(shù)后重新進(jìn)行固相萃取。

表2 不同濃度下的MAX柱的回收率測定結(jié)果

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)待測物的性質(zhì)，配制1000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI+模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，第一步進(jìn)行母離子掃描，確定母離子，并優(yōu)化得到碰撞能。同時(shí)在MRM模式下優(yōu)化了離子源溫度、噴霧器壓力、脫溶劑氣流速。確定優(yōu)化后條件見1.2.2。MRM特征離子譜圖見圖1。

圖1 MRM特征離子譜圖

2.4 校準(zhǔn)曲線和檢出限

將谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品用初始流動相配制成10，20，50，100，200，500 μg/L濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比(S/N)，10倍信噪比(S/N)確定檢出限和定量限。回歸方程為Y=375.63X+720.42，相關(guān)系數(shù)r為0.9998。儀器檢出限為1.5 μg/L，定量限為5.0 μg/L。

2.5 精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.5.1 精密度試驗(yàn)

將某樣品按1.3的方法重復(fù)提取測定6次，測定值見表3，計(jì)算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.4%，精密度符合試驗(yàn)要求。

表3 某樣品重復(fù)6次測定值

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同時(shí)取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，在儀器工作條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。計(jì)算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%，穩(wěn)定性良好，符合試驗(yàn)要求。

表4 谷氨酸鈉穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.3 加標(biāo)回收率

將加標(biāo)樣品按1.3的方法提取，按前述確定的測定條件進(jìn)行測定，確定回收率，結(jié)果見表5，平均回收率為97.9%。

表5 谷氨酸鈉回收率試驗(yàn)

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)

取加標(biāo)供試品(加標(biāo)濃度水平在10.0,50.0,100.0 μg/L)按照1.3的方法提取，按前述確定的測定條件進(jìn)行測定，確定基質(zhì)效應(yīng)。測得基質(zhì)效應(yīng)為95.8%～101.2%。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的色譜圖

2.6 樣品分析

隨機(jī)抽取市售海產(chǎn)品40份，其中包含未加工海產(chǎn)品20份(其中包括魚類、蝦類、貝殼類、軟體動物類)、精加工海產(chǎn)品20份(其中包括散裝和成品包裝的魚類、蝦類、軟體動物類)，應(yīng)用本方法進(jìn)行測定，40份樣品均有谷氨酸鈉檢出(56.1×104～6.35×104mg/kg)，檢出率為100%，其中未加工海產(chǎn)品谷氨酸鈉含量(56.1×103～1.28×103mg/kg)的平均值為5.01×102mg/kg，精加工海產(chǎn)品谷氨酸鈉含量(59.5×104～6.35×104mg/kg)的平均值為1.36×104mg/kg。有部分精加工海產(chǎn)品配料表中沒有加入谷氨酸鈉(其中包括部分散裝產(chǎn)品沒有標(biāo)示是否加入谷氨酸鈉)，精加工海產(chǎn)品谷氨酸鈉檢出最低值與未加工海產(chǎn)品最低值相近，說明部分精加工海產(chǎn)品未加入谷氨酸鈉。而精加工海產(chǎn)品谷氨酸鈉含量平均值顯著高于未加工海產(chǎn)品，與實(shí)際情況相符。

3 結(jié)論

基于海產(chǎn)品類樣品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)，本研究建立了一種快速高效、靈敏、準(zhǔn)確的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)。并對固相萃取樣品前處理方法中的溶劑提取、柱載量等反復(fù)試驗(yàn)，優(yōu)化條件，可滿足市售海產(chǎn)品中谷氨酸鈉含量的測定要求。該方法填補(bǔ)了目前一般食品中尚無谷氨酸鈉國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的空白，同時(shí)對其他食品中谷氨酸鈉檢測方法的研制具有借鑒意義。