鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對(duì)采后柑橘貯藏保鮮的影響

傅雁輝，趙澤文，徐佳明，李賽英，劉 沖，魏賽金

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330045)

【研究意義】柑橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值較高，但采后柑橘易受青綠霉侵染腐爛，不易久藏保鮮，每年都有大量的柑橘在貯藏和運(yùn)輸過程中腐爛變質(zhì)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，青綠霉病、炭疽病、酸腐病等病原菌的侵染是使其發(fā)生腐爛變質(zhì)的主要原因之一[1-2]。當(dāng)前國內(nèi)外防治柑橘果實(shí)采后生理病害主要采取控制溫度、熱處理、保鮮劑處理、氣調(diào)貯藏、涂膜處理、臭氧處理等技術(shù)手段，在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮了重要作用[3-4]。采后柑橘主要病害是由真菌引起的，柑橘采后控制病害主要措施是使用化學(xué)殺菌劑，如咯菌腈、鄰苯基苯酚鈉、賽苯咪唑、噻菌靈、抑霉唑和嘧霉胺等，而這些化學(xué)殺菌劑因持續(xù)使用易產(chǎn)生耐藥性，正逐漸被禁止或被限制使用[5]。因此研究開發(fā)出化學(xué)殺菌劑的替代物來防治果蔬采后病害，是果蔬采后面臨的一項(xiàng)緊迫任務(wù)。利用拮抗微生物及其發(fā)酵活性物質(zhì)來防治果蔬采后病害，開發(fā)成天然防腐劑，減少食品中農(nóng)藥殘留、保護(hù)環(huán)境、確保人體健康等，都具有深刻的意義[6]。【前人研究進(jìn)展】目前應(yīng)用于采后柑橘病害生物防治的微生物主要有細(xì)菌[7-9]、酵母菌[10-11]、類酵母菌[12]和木霉[13]等。放線菌因能產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)而成為生物防治領(lǐng)域的一類重要微生物，并且已有多種抗生素廣泛應(yīng)用到果蔬病害控制中。申光輝等[14]研究獲得的鏈霉菌T3-5菌無菌發(fā)酵液對(duì)草莓采后灰霉病菌具有較強(qiáng)拮抗作用外，且對(duì)草莓果實(shí)品質(zhì)具有較好的維持作用，能夠延緩果實(shí)硬度降低，延緩可溶性固形物、可滴定酸消耗和VC成分的損失。鹿連明等[15]篩選出1株米修鏈霉菌A3202其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)柑橘青、綠霉病和柑橘炭疽病相對(duì)防效可達(dá)100 %。張坤宇等[16]篩選出淡紫灰鏈霉菌X33對(duì)柑橘綠霉病有很強(qiáng)的抑制效果。【本研究切入點(diǎn)】江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室從珙桐植株中分離得到一株產(chǎn)灰褐色孢子的鏈霉菌，命名為JD211，對(duì)菌株JD211進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定其為奈良鏈霉菌(Streptomycesnaraensis)。該菌株所產(chǎn)的環(huán)己酰亞胺類活性物質(zhì)對(duì)水稻稻瘟病菌、紋枯病菌、煙草黑脛病菌、意大利青霉等植物病原菌有強(qiáng)烈的抑制作用[17]。本研究以鏈霉菌JD211固體菌劑發(fā)酵活性粗提物為材料，涂膜處理采后柑橘并自然貯藏，通過測(cè)定柑橘果實(shí)品質(zhì)、過敏性反應(yīng)和病程相關(guān)蛋白，研究鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜對(duì)采后柑橘的影響，旨在為開發(fā)新型綠色無公害的果蔬類防腐保鮮劑提供實(shí)踐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘采自江西九江市農(nóng)民載種柑橘樹(未打農(nóng)藥)，其品種為蜜桔，樹齡27年，果實(shí)八至九成熟。鏈霉菌JD211(StreptomycesJD211)由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究室提供。試劑(分析純)均為市售試劑。

米飯固體培養(yǎng)基：早米500 g，葡萄糖5 g，麥片20 g。

馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

JW-3022HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；721可見分光光度計(jì)，上海佑科儀表有限公司；UV759紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；HH恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠；手持折光儀，江西贛儀科技有限公司；游標(biāo)卡尺，上海一尺業(yè)有限公司。

1.3 鏈霉菌JD211活性物質(zhì)的粗提物制備

先將試管斜面中的JD211接種到茄形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)6～7 d，再將新鮮的早米用清水洗凈，加水浸泡24 h，瀝干水蒸煮40 min，將葡萄糖用少量蒸餾水溶解加入到米飯中，并加入麥片，攪拌均勻，加水至米飯手捏成團(tuán)，落地而散。配置好的固體培養(yǎng)基分裝到蘑菇瓶中，高溫高壓滅菌2 h。再將茄形瓶中的JD211孢子用100 mL無菌水洗下，接種到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶接種15 mL孢子懸液，30 ℃培養(yǎng)8 d。取1粒米飯發(fā)酵物，置于含意大利青霉、指狀青霉培養(yǎng)皿中，30 ℃培養(yǎng)3 d，檢測(cè)活性。用蒸餾水以體積比1∶1浸提培養(yǎng)8 d的固體培養(yǎng)基24 h，離心取上清液，真空抽濾濃縮，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌得到用那他霉素標(biāo)定的抑菌活性為7.98 μg/mL的無菌JD211活性粗提物。

1.4 果實(shí)處理

采摘選取沒有機(jī)械損傷、大小均勻的果實(shí)放入塑料果筐中，靜置過夜。先用2 %次氯酸消毒清洗，再用蒸餾水清洗自然晾干，最后用無菌脫脂棉吸取5 mL鏈霉菌JD211活性物涂膜處理果實(shí)，蒸餾水為對(duì)照，每種處理150個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次[18]。晾干后用聚乙烯薄膜單果包裝，放入塑料果框中，置于室內(nèi)自然貯藏。統(tǒng)計(jì)60 d后失重率和爛果率，每隔10 d取樣測(cè)定果實(shí)品質(zhì)及抗性生理生化指標(biāo)。

1.5 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法

1.5.1 失重率和腐爛率的測(cè)定

失重率=(果實(shí)前一次稱重-果實(shí)后一次稱重)/果實(shí)前一次稱重×100 %

腐爛率=腐爛個(gè)數(shù)/果實(shí)總數(shù)×100 %

1.5.2 果實(shí)品質(zhì)測(cè)定 可溶性固形物(SSC)含量用手持折光儀測(cè)定[19]；可滴定酸(TA)測(cè)定參考Henriod[20]；抗壞血酸(AsA)含量采用 2，6-二氯靛酚滴定法測(cè)定[21]；蒽酮比色法[22]測(cè)定總糖(TSC)含量。

1.5.3 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)過敏性反應(yīng)的影響 過氧化氫酶(CAT)測(cè)定參照隋麗(2009)[23]；脂氧合酶(LOX)活性測(cè)定參照李強(qiáng)(2008)[24]；過氧化氫(H2O2)含量采用二甲酚橙法測(cè)定[25]；硫代巴比妥酸(TBA)比色法[26]測(cè)定丙二醛(MDA)含量。

1.5.4 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)病程相關(guān)蛋白的影響 幾丁質(zhì)酶(CHT)活性測(cè)定參照Mauch[27-28]的方法，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性測(cè)定參照曹健康的方法[29-30]。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析及圖形制作 采用DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平取P=0.05(差異顯著)或P=0.01(差異極顯著)。采用Excel 2016和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌JD211對(duì)意大利青霉和指狀青霉抑菌活性

如圖1所示，鏈霉菌JD211固體發(fā)酵物對(duì)意大利青霉和指狀青霉有較強(qiáng)的抑制效果，對(duì)意大利青霉拮抗圈平均直徑為20.02 mm，對(duì)指狀青霉拮抗圈平均直徑為25.95 mm。

2.2 貯藏效果

腐爛率和失重率是評(píng)價(jià)一種保鮮劑保鮮防腐效果的重要指標(biāo)。從表1可看出，鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜處理的果實(shí)失重率為5.62 %，與對(duì)照相比涂膜處理能有效減少采后柑橘水分散失程度，其原因可能是由于鏈霉菌JD211活性物附于柑橘果皮，阻塞了果皮表面氣孔，從而減少水分散失。處理組涂膜處理果實(shí)腐爛率為10.00 %，極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，這與鏈霉菌JD211活性物本身具有抑菌作用密切相關(guān)，在采后貯藏期間能減少病菌的侵染及病害的發(fā)生。

表1 采后柑橘不同處理自然貯藏第60天的失重率和腐爛率

Table 1 Weight loss and decay rate of postharvest citrus treated with different treatments during the 60th day of natural storage

處理失重率( %)腐爛率( %)對(duì)照6.02±0.31Aa15.33±0.77AaJD211涂膜5.62±0.39Aa10.00±0.77Bb

注：同一列不同大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)，不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

Notes:Different capital letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.01, Different small letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.05.

2.3 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響

果實(shí)在采后貯藏過程中，可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸和總糖等物質(zhì)會(huì)隨著時(shí)間積累和消耗，它們含量的積累和消耗會(huì)影響果實(shí)的品質(zhì)。因此這些指標(biāo)被視為果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖2所示，可溶性固形物(SSC)含量在前期是一個(gè)積累的過程，JD211處理在第20天達(dá)到峰值，對(duì)照組在第10天達(dá)到峰值，分別為 9.30 %和8.06 %。JD211處理在第20天后開始急劇下降，并在貯藏后期第30天后趨于穩(wěn)定；對(duì)照組第20天急劇下降至最低值8.06 %，并在30 d后逐漸趨于穩(wěn)定。貯藏30～60 d期間處理組含量均高于對(duì)照組，說明鏈霉菌JD211活性物質(zhì)涂膜處理柑橘果實(shí)能夠減緩果實(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解速率，延遲衰老進(jìn)程，從而維持較好的風(fēng)味。果實(shí)抗壞血酸含量先升后降低，處理組和對(duì)照組分別在第40和20天達(dá)到峰值，每100 g果肉中含量分別為23.00和22.05 mg。處理后期處理組含量高于對(duì)照組含量。說明鏈霉菌JD211活性物質(zhì)能有效減小果實(shí)中抗壞血酸的氧化分解，從而維持果實(shí)較高的營(yíng)養(yǎng)。果實(shí)可滴定酸(TA)含量變化處理組和對(duì)照組都是先上升后下降，0～10 d可滴定酸含量積累達(dá)到峰值，分別為0.69 %和0.73 %，第10天至末期可滴定酸含量逐漸下降至最低值，貯藏第60天時(shí)可滴定酸含量處理組比對(duì)照組高41.41 %，處理組的下降程度較對(duì)照組平緩，含量比對(duì)照組高，二者差異顯著(P<0.05)。說明JD211活性物處理果實(shí)能夠減緩果實(shí)中可滴定酸的分解速率，有效保持果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。果實(shí)總糖(TSC)含量變化均呈平緩波動(dòng)，對(duì)照組果實(shí)的波動(dòng)較處理組平緩，處理組果實(shí)總糖含量在0～60 d內(nèi)產(chǎn)生兩次波峰，在貯藏第50天兩處理達(dá)到峰值其中處理組較對(duì)照組高6.46 %，0～50 d內(nèi)處理組總糖含量高于對(duì)照組，說明鏈霉菌JD211活性物處理能有效減少采后貯藏過程中對(duì)糖類的消耗，維持果實(shí)品質(zhì)。

圖1 鏈霉菌JD211對(duì)意大利青霉(A)和指狀青霉抑菌(B)效果Fig.1 Inhibitory effect of Streptomyces JD211 on P. Italialis(A) and P. digitatum(B)

圖2 鏈霉菌JD211發(fā)酵提取物對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation extracts of Streptomyces sp. JD211 on fruit quality

2.4 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)過敏性反應(yīng)的影響

如圖3所示，果實(shí)H2O2含量變化在貯藏10 d內(nèi)均是迅速下降，對(duì)照組在第10天后H2O2含量積累逐漸上升并在第60天達(dá)到最大值46.58 μmol/g，處理組在第10天后逐漸上升并在第40天后下降至末期達(dá)到最低值9.02 μmol/g。貯藏第10天后對(duì)照組H2O2含量均高于處理組，二者差異顯著(P<0.05)。說明鏈霉菌JD211活性物涂膜處理果實(shí)，能有效降低果實(shí)膜系統(tǒng)的損害，維持植物體較強(qiáng)的保護(hù)性能。果實(shí)過氧化氫酶(CAT)活性變化趨勢(shì)都是逐漸波動(dòng)上升，對(duì)照組和處理組CAT活性在第50天均達(dá)到峰值，其中處理組比對(duì)照組活性高22.73 %，貯藏前期對(duì)照組CAT活性高于處理組，中后期處理組CAT活性均大于對(duì)照組，二者差異顯著(P<0.05)。說明了鏈霉菌JD211活性物涂膜處理柑橘果實(shí)增強(qiáng)了CAT活性，提高了H2O2的分解能力，減緩了H2O2的影響。果實(shí)丙二醛(MDA)含量變化趨勢(shì)對(duì)照組是逐漸上升，并在第60天達(dá)到最大值0.25 mmol/g，處理組MDA含量變化先上升后趨于平緩，在第20天達(dá)到最大值0.89 mmol/g，對(duì)照組MDA含量在貯藏后期高于處理組，貯藏第60天對(duì)照組含量比處理組高56.84 %，二者差異顯著(P<0.05)。可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理可以抑制MDA含量的積累，減少膜脂過氧化程度，維持膜系統(tǒng)的完整性，從而對(duì)逆境有較好的抗性。果實(shí)脂氧合酶(LOX)活性對(duì)照組變化趨勢(shì)是先上升后趨于平緩，在第20天達(dá)到峰值。鏈霉菌JD211活性物涂膜處理LOX活性呈下降變化，第60天對(duì)照組LOX活性較處理組高 62.34 %， 貯藏期間LOX活性處理組低于對(duì)照組，可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理降低了LOX活性，減緩果實(shí)膜脂過氧化。

2.5 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)病程相關(guān)蛋白的影響

如圖4所示，果實(shí)β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性呈單峰變化。對(duì)照組和處理組GUN活性在貯藏前期均快速上升至峰值，隨后迅速下降。其中第20天處理組GUN活性較對(duì)照組高53.35 %，貯藏10～50 d期間處理組酶活性顯著(P<0.05)高于對(duì)照組，可見鏈霉菌JD211活性物涂膜處理，增強(qiáng)了GUN活性，提高了果實(shí)抗病性。果實(shí)幾丁質(zhì)酶(CHT)活性變化表現(xiàn)為先上升后下降對(duì)照組的峰值出現(xiàn)在第20天為0.0314 U/g FW，涂膜處理峰值出現(xiàn)在第30天為0.0283 U/g FW。涂膜處理的峰值低于對(duì)照組，其上升和下降的幅度均小于對(duì)照組，貯藏第30天后，處理組CHT活性均大于對(duì)照組，第60天處理組較對(duì)照組高94.28 %，可見涂膜處理可以減緩果實(shí)貯藏過程中的CHT活性的波動(dòng)，增強(qiáng)抗病性。

圖3 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)過敏性反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of streptomyces JD211 on allergic reaction of fruits

圖4 鏈霉菌JD211對(duì)果實(shí)病程相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effect of Streptomyces JD211 on Pathogenesis-related protein in fruit

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)采用鏈霉菌JD211固體發(fā)酵提取物涂膜處理采后柑橘，自然貯藏條件下，能有效減少采后柑橘果實(shí)失重率和腐爛率，減緩可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸和總糖的損耗、變化，貯藏后期對(duì)可滴定酸損耗有明顯減緩效果，維持了果實(shí)的品質(zhì)。這與申光輝等[14]對(duì)草莓防腐保鮮結(jié)果類似。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量的多少可以反應(yīng)出植物的抗逆性和膜系統(tǒng)受損傷程度，隨著貯藏時(shí)間的增加，果實(shí)逐漸衰老，MDA含量也會(huì)逐漸上升。脂氧合酶(LOX)是廣泛存在于植物體中的與膜脂過氧化過程有關(guān)的酶，其活性的增加可能會(huì)加速細(xì)胞膜脂過氧化，促進(jìn)果實(shí)衰老[31]。鏈霉菌JD211活性物涂膜處理柑橘果實(shí)能有效的減少貯藏期間MDA的積累，延緩LOX活性高峰的出現(xiàn)，處理組LOX活性直到第50天才達(dá)到峰值，說明JD211涂膜處理延緩了細(xì)胞膜脂過氧化程度，從而有效減緩了柑橘果實(shí)發(fā)病程度和時(shí)間。H2O2是生物體內(nèi)各種生理代謝的副產(chǎn)物，是一種氧化脅迫因子，植物組織遭受各種非生物及生物脅迫時(shí)，它的含量迅速升高，過量H2O2會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[32]。過氧化氫酶(CAT)通過清除植物組織細(xì)胞內(nèi)H2O2，增強(qiáng)抗氧化能力。植物在受到病原菌侵染后，通過與病原菌相互作用誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的活化，合成抗菌物質(zhì)及防御蛋白，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)和幾丁質(zhì)酶(CHT)都屬于這類蛋白。CHT和GUN主要降解幾丁質(zhì)和葡聚糖，這兩種物質(zhì)都是病原菌細(xì)胞壁的主要成分[33]。本研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌JD211活性物涂膜處理延緩了GUN和CHT活性的峰值和活性，提高和延長(zhǎng)了病程相關(guān)蛋白酶活性，增強(qiáng)了果實(shí)的抗病性。

4 結(jié) 論

鏈霉菌JD211固體發(fā)酵活性物不僅對(duì)柑橘病原真菌意大利青霉和指狀青霉有強(qiáng)烈的拮抗作用，同時(shí)涂膜處理采后柑橘，對(duì)采后柑橘自然貯藏果實(shí)品質(zhì)維持、果實(shí)過敏性和抗病性有較好的效果，具有開發(fā)成采后柑橘保鮮劑的潛力。