響應面法優化樺菌芝三萜超聲提取工藝

黑育榮, 陳勝發, 彭修娟,楊新杰

(1.楊凌職業技術學院, 陜西 楊凌 712100;2.陜西國際商貿學院,陜西 咸陽 712046； 3.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046)

樺菌芝 [Pyropolyporusfomentarius(L. ex Fr.)]又名木蹄、多寄生于樺樹及櫟樹的樹干上，樺菌芝的藥用活性之一是抗癌，民間治療子宮癌、食道癌、胃癌多有應用[1,2,3]。目前對樺菌芝的研究，主要集中在樺菌芝多糖的抗癌作用機制[4]，樺菌芝的另一抗癌活性成分為三萜類成分[5]，對樺菌芝的三萜類成分的研究較少。筆者實驗通過響應曲面分析法優化樺，菌芝三萜類成分的超聲提取工藝，給樺菌芝三萜的研究和開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C2H5OH、濃H2SO4、HClO4、冰CH3COOH、醋酸酐、香草醛等(均為分析純)。樺菌芝(野生)；齊墩果酸對照品(110709-201607，中國藥品生物制品檢定所)；

1.2 儀器

YP20002型電子天平，KQ5200DE型數控超聲波清洗器，DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱，HH-2型電熱恒溫水浴鍋，SHZ-D(ш)型循環水用真空泵，UPT-I-10T型超純水機，UV-1901型紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲提取樺菌芝三萜 準確稱取樺菌芝粉末，置錐形瓶內，以設定濃度的乙醇溶液和料液比，設定超聲溫度、時間，進行提取，過濾得提取液，測定濾液中樺菌芝三萜的含量，并計算三萜的得率。

1.3.2 對照品溶液的配制 稱取適量齊墩果酸對照品，加入一定體積的甲醇，配制成0.1953 mg·mL-1的對照品溶液。

1.3.3 標準曲線的繪制 以齊墩果酸為標準品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色，以可見分光光度法測定總三萜含量[6]，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的對照品溶液，分揮干，加入0.2mL 5%香草醛冰乙酸和0.8mL高氯酸，60℃水浴中反應15 min，冰水浴冷卻, 加冰乙酸定容到5 mL，同法作為空白，測定550 nm處的吸光度值。以齊墩果酸(mg)x為橫坐標，吸光度值(A)y為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 樺菌芝三萜含量測定 準確量取樣品液1 mL，置25 mL具塞試管中，揮干溶劑按香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法顯色，平行測定3次。

1.3.5 單因素實驗 分別考察50%，60%，70%，80%，90%的乙醇濃度，在40℃、50℃、60℃、70 ℃、80℃的條件下超聲，分別設定10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的超聲時間，以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，對樺菌芝提取液中三帖類物質含量的影響。

1.3.6 響應面優化 分別以乙醇濃度、溫度，時間和料液比為因素，以三萜得率為響應值，以Box-Benhnken的原理，進行響應面分析。

1.3.7 分析數據 用Design-Expert.8.0.6.1軟件分析數據

2 結果與分析

2.1 標準曲線

如圖1，回歸方程為：Y =8.8208X + 0.1157，R2=0.9998。

圖1 齊墩果酸標準曲線

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇濃度對三萜得率的影響 由圖2中可以看出，乙醇濃度為50%～70%之間，三萜得率隨著濃度增加逐漸增大，當濃度增大到70%時三萜得率最大。因此，最佳醇乙濃度為70%。

圖2 乙醇濃度對三萜得率的影響

2.2.2 提取溫度對三萜得率的影響 從圖3可知，隨著溫度的升高三萜得率逐漸增大。溫度達到70℃時，三萜得率增加至最大。由70℃到80℃，三萜得率呈下逐漸下降。過高溫度可能會對三萜的結構產生破壞從而影響提取率。經分析得出：提取溫度應選擇70℃。

2.2.3 提取時間對三萜得率的影響 從圖4可以看出，在10～15 min，三萜得率緩慢增加，時間為15 min時增加至最高值，而在15～30 min之間，三萜得率呈現逐漸減少的趨勢，可以得出，提取時間控制在15 min左右較為適宜。

圖3 提取溫度對三萜得率的影響

圖4 提取時間對三萜得率的影響

2.2.4 料液比對三萜得率的影響 從圖5可以看出，料液比為1∶15時三萜得率最大，故本次實驗的料液比控制在1∶15。

圖5 料液比對三萜得率的影響

2.3 響應面法實驗結果

2.3.1 響應面法實驗設計 按照單因素實驗結果，根據Box-Benhnken中心組合實驗設計的原理，進行4因素3水平實驗，見表1。

表1 實驗因素及水平

2.3.2 回歸模型方程建立與方差分析 以樺菌芝提取液中三帖得率為指標，依據Box-Behnken響應曲面法超聲提取樺菌芝三萜的工藝優化，得到設計的29組實驗結果，見表2。

表2 響應面實驗設計及數據處理

應用軟件Design-Expert.8.0.6.1進行分析，得到回歸模型方程：

R1=-29.02533+0.47512A+0.31737B+0.32043C+0.37260D-3.25×10-4AB+1.00×10-5AC-1.5×10-3AD-5.50×10-4BC+4.2×10-3CD+6×10-3CD-3.0675×10-3A2-2.505×10-3B2-0.01247×C2-0.021720D2

回歸分析結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析

通過表2數據分析可知，此模型的F值是2.99，方程的“Prob> F”數值小于0.05，表明相應因素對響應值影響顯著。從回歸方程的方差與分析結果看出，該方程的失擬項特別小，說明方程對實驗的擬合情況良好。通過以上實驗數據及結果分析均可表明該模型用于優化三萜類物質的提取工藝是非常可靠的。

2.3.3 響應面法分析 應用Design-Expert.8.0.6.1軟件繪制乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲提取時間、料液比等因素交互作用對樺菌芝提取液三萜類物質含量影響的響應曲面圖和等值線圖，結果詳見圖6,續圖6。

圖6 提取液中三萜類物質含量各因素交互作用影響的響應面與等值線

續圖6 提取液中三萜類物質含量各因素交互作用影響的響應面與等值線

根據Design-Expert 8.0.6.1 Trial軟件對模型方程計算得到：乙醇濃度70.33%、提取溫度在69.67℃，提取時間15.20 min料液比為1∶14.98理論值為3.97%。

2.3.4 驗證 應用到實際生產中工藝設定為：乙醇濃度70%、超聲提取溫度70℃、超聲提取時間15 min料液比為1∶15。在此條件下，平行實驗三次，實際測得樺菌芝三萜得率為3.87%，相比模型的提取率降低了約0.09%左右。由此證明，筆者實驗所得最優提取工藝實用可行。

3 結論

以乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比四個因素進行單因素水平實驗，然后通過Box-Behnken原理設計，建立出模型，對實驗結果進行分析，得到超聲提取樺菌芝三帖最優工藝條件：乙醇濃度70%，超聲溫度70℃，超聲時間15 min，料液比1∶15。在最佳工藝條件下重復平行實驗，實驗結果樺菌芝三萜平均取率為3.87%。筆者試驗的理論數據可以為實際的樺菌芝三萜提取工藝優化和工業生產所參考。