產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌發酵條件的優化及穩定性檢測

瑪依拉·吐爾地別克

摘 要：試驗研究了產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌的最佳發酵條件，如溫度、pH值、時間。分別將培養溫度設為24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值為6、7、8，培養時間為5 d和7 d，采用紙片法測量抑菌圈的大小。pH值為6，時間為7 d，溫度為24 ℃、28 ℃、32 ℃。由抗菌活性大小分析得出，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株在溫度為24 ℃時的抑菌圈最大，因此具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌最適溫度為24 ℃，pH值為6，時間為7 d，且抑菌能力較強。產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌的生物學特性包括溫度和酸堿穩定性，結果如下：YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3種菌珠所產抑菌質在45 ℃時的抑菌效果最好，YLAC-20的熱穩定性最弱，菌株YLAC-3和YLAC-69的熱穩定性最強，且耐高溫，其抑菌活性不受影響，故在內生真菌次生代謝產物中可有效利用。產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌所產抑菌物質在酸性條件下抑菌效果最好，在pH值為4～8時，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3種菌株對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌效果不同。由抑菌活性表可知，產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌物質耐堿性，在堿性條件下抑菌效果較強。這為提高烏頭堿產量奠定了基礎。因此，產烏頭堿內生真菌的研究更加有意義，有待深入研究。

關鍵詞：烏頭;內生真菌;抑菌活性

文章編號：1004-7026（2019）15-0094-05 ? ? ? ? 中國圖書分類號：Q946 ?? ? ? ?文獻標志碼：A

植物內生真菌（Endophyte fungus）是指在健康植物中寄生的，在各種組織和器官內部或細胞間隙中完成部分或全部生活周期而不使宿主表現明顯病理癥狀的一類真菌[1]。目前，國內外對植物內生真菌的研究報告較多，由此可以發現許多植物中的天然化合物與植物內生真菌有密切關系，甚至是內生真菌的次生代謝產物。近年來，國內外學者陸續發現植物內生真菌能產生抗癌物質，為解決抗癌藥物的供應問題開辟了一條新的道路。

烏頭是毛茛科（RanuncμLaceae）中的一類重要植物，物種極為豐富，全球約有350種，分布于北半球溫帶，主要分布于亞洲，其次為歐洲和北美洲[2]。藥用植物的生長周期較長，分離提取的步驟復雜，生物資源不豐富，而植物的內生真菌生長周期短，可以產生與植物相似的次級代謝產物，因此可以利用微生物產生藥用價值的次級代謝產物[3]。

在烏頭植物的內生真菌中，有抗菌活性且活性高的菌株主要分布在烏頭的根部，并且有3株內生真菌抗菌譜最廣，它們分別是曲霉、毛殼菌屬和毛霉。有研究對分離出的烏頭內生真菌進行了抗菌活性篩選，其中有抗菌活性的菌株占內生真菌總菌數的35.98%，抗菌活性菌株中高活性菌株占比高達71.19%，這些結論足以表明烏頭的內生真菌中有很多具有抗菌活性的菌株[4]。烏頭屬植物的內生菌資源非常豐富，因此對烏頭屬植物內生菌進行分離，并且從中篩選出具有生物活性作用的內生菌株，具有重要的意義，值得深入研究。

近年來，人們對藥用植物的需求量與日俱增，藥用植物資源開發利用也受到了人們的廣泛關注。烏頭類中藥具有鎮痛抗炎和抗休克的作用，可以擴張外周血管、抗氧化。對烏頭研究較多的是藥效、藥用成分的分離提取、毒性、種植、田間管理和病蟲害的防治等[5]。從上述研究結果可知，烏頭的許多成分均具有抗腫瘤、抗菌和鎮痛等作用，而且效果明顯，具有良好的開發前景。

試驗對產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌發酵溫度、pH值、時間的優化進行了研究。將分別將培養溫度設為24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值控制為6、7、8，培養時間為5 d和7 d，采用紙片法測定抑菌圈的大小。得到的結果為：pH值為6，時間為7 d，溫度為24 ℃、28 ℃、32 ℃時，通過抗菌活性大小分析得出YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株的溫度為24 ℃時抑菌圈最大，因此可以確定具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌處于24 ℃的環境下，pH值為6，培育時間為7 d時，抑菌能力較強。

產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌的生物學特性包括對熱、酸堿穩定性的研究，結果如下。YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3種菌珠所產的抑菌質在45 ℃的環境中的抑菌效果最好，其中YLAC-20的熱穩定性最弱，菌株YLAC-3和YLAC-69的熱穩定性最強，其耐高溫性和抑菌活性不受影響，故在內生真菌次生代謝產物中可有效利用。產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌所產抑菌物質在酸性條件下的抑菌效果最好，在pH值為4.0～8時，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69 3株菌株對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制效果不同，在抑菌活性表中可知產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌物質耐堿性，在堿性條件下抑菌效果較強，這為提高產烏頭堿的產量打下了基礎。因此產烏頭堿內生真菌的研究更加有意義，需要深入研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株

試驗所用的菌株是由伊犁師范大學微生物實驗室保藏的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69。

1.1.2 ?指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）CGMCC1.110 3株、草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）CGMCC1.769、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和酵母菌CGMCC1.1103，均由伊犁師范學院生物與地理科學學院微生物實驗室保存。

1.1.3 ?主要儀器

主要儀器有旋轉蒸發儀器（德國IKA/艾卡廣州儀器設備有限公司）、高速冷凍離心機HC-3018R（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、振蕩培養箱HYG-A（上海璽袁科學儀器有限公司）和超凈工作臺SWCJ1F（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）。

1.1.4 ?主要試劑和培養基

牛肉膏蛋白胨培養基用于指示菌的培養，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基和馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養基用于真菌培養。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?具有抑菌活性內生真菌的活化

將實驗室中已分離并純化保存的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌菌種接種于PDA固體培養基和PDB液體培養基中，在28 ℃的環境中培養，連續活化3代，儲存于4 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 ?指示菌的培養

將大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃葡萄球菌的單菌落分別接種于100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養基，在37 ℃的環境中培養18 h，將酵母菌單菌落接種于100 mL的PDB培養基，在28 ℃的環境中培養48 h，取400 μL菌液接種于PDA培養基上，用無菌玻璃環進行涂抹，用于抑菌試驗。

1.2.3 ?不同發酵條件對具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌生成的影響

將具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌分別接種于濃度為1 mol/L的氯化氫和氫氧化鈉中，將PDB培養基的初始pH值分別調至6、7、8，在121 ℃的環境中滅菌30 min后，培養溫度分別調至24 ℃、28 ℃、37 ℃，培養時間分別為5 d和7 d，離心后收集上清液，用0.22 μm的過濾器過濾除菌，用旋轉蒸發儀將100 mL發酵液濃縮至1 mL，觀察抑菌圈的大小。

采用紙片擴散法檢測產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌發酵液對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和酵母菌的抑菌作用，具體步驟如下。將紙片放置于涂有指示菌的平板上并點入20 μL的發酵液，在28 ?℃的環境中培養1～2 d，觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.2.4 ?產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌發酵上清液的制備

將活化好的內生真菌菌株YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69接種于PDB液體培養基中，在28 ℃的環境中培養7 d后離心（4 ℃，8 000r/min，20min），取上清液，置于4 ℃的冰箱中保存備用。

1.2.5 ?抑菌物質的理化特性

（1）不同熱處理對產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌所產抑菌物質的抑菌活性影響。倒平板：將PDA平板加熱到完全融化，倒在培養皿內，每皿20 mL（下層），待其凝固后，吸200 μL供試菌菌懸液置于平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。溫度處理：分別在不同的溫度（45 ℃、60 ℃、80 ℃）下，將內生真菌菌株發酵上清液處理10 min。紙片法： 將含有不同菌種發酵上清液濾紙片貼在已接種指示菌待測的平板表面上，每個菌株設置2個重復，放置37 ℃的環境中培養，測量抑菌圈的直徑并記錄。

（2）不同pH值對產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌所產抑菌物質的抑菌活性影響。倒平板：制備PDA平板加熱到完全融化，倒在培養皿內，每皿20 mL（下層），待其凝固。吸取200 μL供試菌加入平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。pH處理：分別用1 mol/L 的氯化氫和2 mol/L的氫氧化鈉將乳酸菌菌株發酵上清液調為不同的pH值（4、5、6、7、8）。紙片法：將含有不同菌種發酵上清液濾紙片貼在已接種指示菌待測的平板表面上，每個菌株設置2個重復，放于37 ℃的環境中培養，測量抑菌圈的直徑并記錄。

2 ?結果與分析

2.1 ?具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌發酵液隨不同pH值、時間和溫度的變化情況

將培養溫度設為24 ℃，pH值為6、7、8，培養時間為5 d和7 d，檢測產烏頭堿內生真菌分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，結果發現YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的發酵液在pH值為6，培養時間為7 d時，抑菌圈最大，其中YLAC-3的pH為6，培養時間為7 d的抑菌效果最好，因此以上3株最適合的pH值為6，最佳培養時間為7 d，見表1。

將培養溫度設為28 ℃，pH為6、7、8，培養時間為5 d和7 d，檢測產烏頭堿內生真菌分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，結果可知YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的發酵液在pH為6，培養時間為7 d時抑菌圈最大，28 ℃時抑菌能力比24 ℃時抑菌效果能力弱。其中，在28 ℃的環境中，YLAC-69的pH值為6，培養時間為7 d時抑菌效果最好，因此以上3株最適合的pH值為6，最佳培養時間為7 d，見表2。

將培養溫度設為32 ℃，pH為6、7、8，培養時間為5 d和7 d，檢測產烏頭堿內生真菌分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌活性，結果可知YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69的發酵液在pH值為6，培養時間為7 d時抑菌圈最大，在32 ℃時沒有在24 ℃和28 ℃時的抑菌效果明顯。其中在32 ℃的環境中，YLAC-69的pH值為6，培養時間為7 d時抑菌效果最好，因此以上3株最適合的pH值為6，最佳培養時間為7 d，見表3。

綜上所述，具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌在最適pH值與最佳時間的基礎上，當溫度分別為24 ℃、28 ℃、32 ℃時，通過檢測對不同菌株的抑菌能力，得出產烏頭堿內生真菌最適合的培養溫度為24 ℃，最適pH值為6，最佳培養時間為7 d。

2.2 ?產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌對熱處理的穩定性

產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌經過不同的溫度處理時，其抑菌效果的變化為：YLAC-3所產抑菌物質在45 ℃時的抑菌效果最好，枯草芽孢桿菌抑菌圈達到11 mm，溫度分別為60 ℃、80 ℃和100 ℃，10 min后效果有所降低;YLAC-20所產抑菌物質在45 ℃時的抑菌效果最好，大腸桿菌的抑菌圈為8 mm，溫度為60 ℃、80 ℃和100 ℃，10 min后效果有所降低;YLAC-69 所產抑菌物質在45 ℃時的抑菌效果最好，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈達到9 mm，溫度為60 ℃、80 ℃、100 ℃，10 min后效果有所降低，見表4。菌株YLAC-3和YLAC-69有最強的熱穩定性，耐高溫，其抑菌活性不受影響，故在內生真菌次生代謝產物中可有效利用，YLAC-20的熱穩定性最弱。

2.3 ?產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌對pH的穩定性

產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌對不同pH的穩定性見表5。

pH值為4時，YLAC-20對大腸桿菌的抑菌效果最好，YLAC-20>YLAC-3>YLAC-69。YLAC-3對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。對酵母菌的抑菌效果依次為YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。

pH值為5時，YLAC-3和YLAC-69對大腸桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。YLAC-3對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC

-20。對酵母菌的抑菌效果最依次為YLAC-3、YLAC-69>YLAC-20。

pH值為6時，YLAC-69對大腸桿菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-3對酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。

pH值為7時，YLAC-69對大腸桿菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-20>YLAC-3。YLAC-3對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-69對酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。

pH值為8時，YLAC-69對大腸桿菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-20>YLAC-3。YLAC-3對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，YLAC-3>YLAC-69>YLAC-20。YLAC-69對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。YLAC-69對酵母菌的抑菌效果最好，YLAC-69>YLAC-3>YLAC-20。

因此，具有抑菌活性產烏頭堿的內生真菌物質在堿性條件下的抑菌效果較強。

3 ?結束語

由于大部分中藥含大量生物堿，是中藥的活性成分，因此研究植物內生真菌，為解決天然藥用植物解決資源匱乏的問題已成為有關人員的重要工作。有些觀點認為，內生真菌長期生活在植物體內，在與宿主植物體長期共同進化的過程中，內生真菌與寄主植物宿主之間存在著基因的橫向轉移，它們之間的基因存在相互交換的現象[6]。

試驗將具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌分別接種于用濃度為1 mol/L的氯化氫和氫氧化鈉鈉中，將PDB培養基的初始pH分別調至6、7、8，在121 ℃的環境中滅菌30 min，培養溫度分別調至24 ℃、28 ℃、32 ℃，培養時間分別為5 d和7 d，離心后收集上清液，用0.22 μm的過濾器過濾除菌，用旋轉蒸發儀將100 mL的發酵液濃縮至1 mL，觀察抑菌圈大小。

采用紙片擴散法檢測產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌發酵液對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌以及酵母菌的抑菌作用，把紙片放置于涂有指示菌的平板上并點入20 μL的YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株的發酵液，通過試驗對溫度為24 ℃、28 ℃、32 ℃，pH值為6、7、8，時間為5 d、7 d時測定抑菌圈的大小，最終確定具有抑菌活性產烏頭堿內生真菌在溫度為24 ℃、pH值為6、時間為7 d時的抑菌能力較強。

分析不同熱處理對菌株所產抑菌物質的抑菌活性的影響發現，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌珠所產抑菌質在45 ℃的抑菌效果最好，其中YLAC-20表現最弱的熱穩定性，菌株YLAC-3和YLAC-69表現最強的熱穩定性，菌株高溫，抑菌活性不受影響，故在內生真菌次生代謝產物中可有效利用。

在產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌所產抑菌物質在酸性條件下抑菌效果最好，在pH值為4～8時，YLAC-3、YLAC-20、YLAC-69菌株對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌效果不同，產烏頭堿具有抑菌活性內生真菌物質耐堿性，在堿性條件下抑菌效果較強。

從國內外研究可知，烏頭的許多成分均具有抗腫瘤、抗菌和鎮痛等生物學特性，且表現良好，具有很好的開發潛力。

參考文獻：

[1]A.V Sturz，J Nowak. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield

enhancing associations with crops[J].Applied Soil Ecology，2000，15（2）：183-190.

[2]關文靈.藥用花卉烏頭[J].植物雜志，2002（1）：16.

[3]李向楠，周稚凡，劉風路，等.云南榧種子內生真菌的分離鑒定及抑菌活性篩選[J].生物災害科學，2016，39（1）：

20-26.

[4]李治瀅，李紹蘭，楊麗源，等.藥用植物烏頭內生真菌抗菌活性研究[J].現代農業科技，2009（22）：90-92.

[5]李治瑩，陳有為，楊麗源，等.藥用植物烏頭內生真菌研究[J].現代農業科技2009（7）：7-8.

[6]Pandi M， Rajapriya P， Manoharan P T. Extraction and Characterization of Taxol： An Anticancer Drug from an

Endophytic and Pathogenic Fungi[M].Laboratory Protocols in Fungal Biology. Springer New York， 2013.