亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性熒光PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

劉秀卿，李延武，李卓成

(深圳市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518035)

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)多態(tài)性，特別是677位點(diǎn)與多種臨床疾病相關(guān)[1-2]；有研究認(rèn)為MTHFR基因C677T多態(tài)性和血漿同型半胱氨酸水平、H型高血壓合并冠心病發(fā)病有一定相關(guān)性[3]；677位點(diǎn)基因突變可導(dǎo)致酶活性下降，造成葉酸代謝障礙，引發(fā)多種新生兒出生缺陷及妊娠期疾病。所以對(duì)該基因的基因型檢測(cè)在臨床上具有重要意義。臨床上單核苷酸基因多態(tài)性的檢測(cè)方法較多，包括TaqMan熒光PCR法、熒光PCR溶解探針法、焦磷酸測(cè)序法、基因芯片檢測(cè)方法、磁珠微粒法以及高通量測(cè)序法等[4-9]。溶解曲線探針法容易受到反應(yīng)實(shí)際組分差異的影響，如離子濃度差異導(dǎo)致溶解曲線的輕微變性導(dǎo)致結(jié)果判斷受干擾；焦磷酸測(cè)序、基因芯片檢測(cè)操作復(fù)雜，流程較長(zhǎng)，不適合臨床廣泛使用；高通量測(cè)序方法的檢測(cè)通量大，但同樣操作復(fù)雜，而且后續(xù)的數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，需要專業(yè)的生物信息學(xué)分析人員分析結(jié)果。TaqMan熒光PCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、檢測(cè)通量適中、檢測(cè)結(jié)果易于判斷、臨床應(yīng)用廣泛，是一種適合單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的方法。本文基于TaqMan探針檢測(cè)方法，期望建立一種適合于臨床推廣應(yīng)用的MTHFR基因667位點(diǎn)快速檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年7-12月于深圳市第二人民醫(yī)院就診患者的已檢測(cè)標(biāo)本。女193例，男107例，年齡18～86歲，中位數(shù)43歲，其中120例來至婦產(chǎn)科，為平滑肌瘤、卵巢囊腫及接受人工流產(chǎn)的婦科患者；120例來至心內(nèi)科，為胸悶、高血壓、心肌梗死和冠狀動(dòng)脈性心臟病患者；另外60例來至體檢科，為體檢健康人員。真空采血管采肘前靜脈血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，每個(gè)樣本均分為2管，保存于-70 ℃超低溫冰柜，凍融次數(shù)不超過3次。

1.2試劑與儀器 10×Taq buffer(Mg2+plus)、dNTP(含dUTP) 、HS-Taq和UNG酶購(gòu)自日本Takara公司；25 mmol/L MgCl2購(gòu)自中國(guó)北京普洛麥格公司；甘油購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)DP348；核酸擴(kuò)增儀購(gòu)自中國(guó)珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)HeMa9600；熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)艾本德公司，型號(hào)5417C/R；超微量分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Implen公司，型號(hào)P-330-31。

1.3方法

1.3.1引物探針設(shè)計(jì) 從美國(guó)NCBI基因庫(kù)下載人MTHFR基因的參考基因序列(NG_013351.1)，選定第4外顯子上的rs1801133多態(tài)性位點(diǎn)(c.C677>T)前后各800個(gè)核苷酸，用Primer Premier 5.0及Primer Express 3.0軟件針對(duì)MTHFR677位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物和熒光PCR引物及TaqMan-MGB探針。引物、探針由大連寶生物公司合成，見表1。

表1 測(cè)序PCR引物和熒光PCR引物探針

注：1*表示羧基熒光素；2*表示六氯熒光素；3*表示小溝結(jié)合物

將設(shè)計(jì)的熒光檢測(cè)引物在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站比對(duì)，共比對(duì)到25條MTHFR基因序列，其中有1條序列(EF.026975.1)在677F2有1堿基突變，突變后的序列為：CCG AAG CAG GGA TCT TTG。該引物組和序列AL031594.9有部分序列錯(cuò)配，其中677R2在該序列97375-97358位置有錯(cuò)誤匹配，匹配序列為TGC ATG CCT TCA CAA，錯(cuò)配部分的DNA的熔解溫度(Tm值)為46.1 ℃；677R2在該序列95681-95698位置有錯(cuò)誤匹配，匹配序列為CAT GCC TTC ACA A，錯(cuò)配部分的Tm值為34.0 ℃。由于錯(cuò)配引物的Tm值和完全匹配的引物Tm差異較大，可以通過提升熒光檢測(cè)PCR的退火溫度避免引物錯(cuò)配。

1.3.2普通PCR及測(cè)序反應(yīng) 在核酸擴(kuò)增儀上進(jìn)行。MTHFR 667位點(diǎn)的PCR總反應(yīng)體系為40 μL，包括10×Taq buffer(Mg2+plus)4 μL，2 U HS-Taq Ex 0.4 μL，25 mmol/L dNTP 0.32 μL，上游引物(667F1)終濃度0.2 μmol/L，下游引物(667R1)終濃度0.2 μmol/L；模版DNA 20 ng，反應(yīng)40 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)數(shù) 40；72 ℃ 5 min。用正反引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.3熒光定量PCR反應(yīng)建立 在熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。熒光PCR檢測(cè)體系參考HS-Taq Ex酶說明書的組分濃度，在0.2～0.4 μmol/L范圍內(nèi)優(yōu)化引物探針濃度，0.2～0.5 mmol/L范圍內(nèi)優(yōu)化Mg2+濃度，0%～5%濃度范圍內(nèi)優(yōu)化甘油濃度。最總選定PCR反應(yīng)總體積為40 μL，包括終濃度1×PCR Buffer，0.05 U/μL 的HS-Taq Ex，UNG酶 0.2 μL，25 mmol/L dNTP(含dUTP)0.4 μL，4.5 mmol/L Mg2+，3%甘油，上、下游引物(667F2/667R2)各0.20 μmol/L，667T探針、667C探針各0.25 μmol/L；模版DNA 20 ng，ddH2O補(bǔ)足至40 μL。最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化，主要在55～62 ℃優(yōu)化退火溫度。隨著退火溫度的提高(至62 ℃)，熒光PCR體系可更好檢測(cè)位點(diǎn)的野生型和突變型。隨著退火溫度進(jìn)一步升高，熒光PCR檢測(cè)信號(hào)降低。選定熒光PCR的退火溫度為62 ℃。對(duì)比三步PCR方法(95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán))和兩步PCR方法(95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán))，對(duì)相同樣本檢測(cè)的循環(huán)閾值(Ct值)差值(△Ct)在1以內(nèi)。最終選定循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)在62 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

結(jié)果判讀：將每個(gè)檢測(cè)通道的Ct值記錄為FAM通道和VIC通道。通過計(jì)算CtF與CtV差值的絕對(duì)值(△Ct=|CtF-CtV|)來判斷基因型，△Ct=3.0為突變型和野生型的臨界值。如雜合突變型時(shí)則△Ct<3.0；當(dāng)△Ct>3.0時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩種情況：如純合野生型則CtF

最低檢測(cè)限確定：用Sanger測(cè)序法確定MTHFR 667位點(diǎn)野生型、純合突變型和雜合型臨床樣本基因組DNA。依據(jù)高濃度梯度差距大，低濃度梯度逐步降低的原則選定測(cè)試濃度，稀釋梯度分別為10、5、2.5和2倍，用緩沖液分別稀釋至50.0、5.0、1.0、0.4和0.2 ng/μL作為驗(yàn)證靈敏度樣本，重復(fù)檢測(cè)每個(gè)濃度10次。

精密度確定：用Sanger測(cè)序法確定選定MTHFR 667位點(diǎn)野生型、純合突變型和雜合型臨床樣本基因組DNA，用緩沖液稀釋至5 ng/μL和1 ng/μL 2個(gè)濃度，用TaqMan熒光PCR試劑對(duì)上述樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本分別檢測(cè)20次。以FAM通道和VIC通道Ct的變異系數(shù)小于5%為合格條件，統(tǒng)計(jì)2個(gè)通道的△Ct的結(jié)果。

臨床驗(yàn)證：根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，選定300例臨床樣本用于驗(yàn)證本文建立的檢測(cè)方法。驗(yàn)證流程包括：用外周血基因組DNA提取試劑盒提取純化臨床樣本，基因組DNA濃度和純度檢測(cè)(P-330-31型微超微量分光光度計(jì)測(cè)定)。用TaqMan熒光PCR試劑檢測(cè)樣本基因組DNA。用Sanger測(cè)序法作為對(duì)照方法驗(yàn)證開發(fā)的TaqMan熒光PCR的檢測(cè)準(zhǔn)確度。

2 結(jié) 果

2.1最低檢測(cè)限分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步選定本檢測(cè)試劑的靈敏度是2 ng/反應(yīng)的人基因組DNA。對(duì)野生型、純合突變型和雜合突變型三種型別的樣本，均稀釋至該濃度(0.4 ng/μL)樣本，分別重復(fù)檢測(cè)20次，確定試劑盒的最低檢測(cè)限是2 ng/反應(yīng)。 見圖1。

2.2精密度分析 FAM通道和VIC通道2個(gè)通道Ct值的變異系數(shù)均小于5%；純合野生型和純合突變型的△Ct變異系數(shù)較小(<12.00%)；雜合突變型的變異系數(shù)較大(9.57%～54.55%)。原因是因?yàn)閮煞N純合型的2個(gè)通道△Ct較大而雜合突變型的2個(gè)通道△Ct較小。在檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差相似的情況下，雜合突變型的△Ct變異系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于純合型。見表2。

2.3準(zhǔn)確度分析 用熒光PCR方法檢測(cè)300例臨床樣本的核苷酸類型，以測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行比對(duì)。熒光PCR檢測(cè)結(jié)果如下：MTHFR 677 CC型155例，MTHFR 677 CT型96例，MTHFR 677 TT型49例。與核酸序列測(cè)定結(jié)果相比較，結(jié)果一致性為100%。見圖2。

注：A表示MTHFR 667位點(diǎn)野生型樣本檢測(cè)結(jié)果；B表示MTHFR 667位點(diǎn)純合突變型樣本檢測(cè)結(jié)果；C表示MTHFR 667位點(diǎn)雜合突變型樣本檢測(cè)結(jié)果
圖1最低檢測(cè)限濃度樣本的檢測(cè)結(jié)果

表2 MTHFR 667位點(diǎn)精密度檢測(cè)結(jié)果

注：A表示MTHFR 667位點(diǎn)野生型樣本檢測(cè)結(jié)果；B表示MTHFR 667位點(diǎn)純合突變型樣本檢測(cè)結(jié)果；C表示MTHFR 667位點(diǎn)雜合突變型樣本檢測(cè)結(jié)果
圖2 MTHFR 677位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

3 討 論

建立一種快速檢測(cè)MTHFR 677位點(diǎn)的TaqMan熒光PCR方法。通過設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)MTHFR 677位點(diǎn)多態(tài)性的兩種TaqMan-MGB探針，用兩種熒光染料分別標(biāo)記兩種檢測(cè)探針，在1個(gè)PCR反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)兩種基因型。在PCR檢測(cè)結(jié)束后，通過計(jì)算每個(gè)樣本兩種熒光探針對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道的△Ct的絕對(duì)值，并比較兩個(gè)檢測(cè)通道Ct值的大小，判定該位點(diǎn)的基因型[6]。由于檢測(cè)位點(diǎn)只有1個(gè)堿基差異，堿基序列差異小，使用TaqMan-MGB探針可選擇更短的探針，以便1個(gè)堿基的差異的Tm值差異更大，有利于提高檢測(cè)的特異性。同樣是由于兩種探針對(duì)同1種檢測(cè)靶序列只有1個(gè)堿基差異，實(shí)際上無法做到探針完全無交叉檢測(cè)，所以本研究采用兩種探針對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道的△Ct的絕對(duì)值來判斷檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。因?yàn)榉瞧ヅ浒袠?biāo)的探針即使能非特異結(jié)合待檢測(cè)模版，但其匹配效率會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于和靶標(biāo)完全匹配的探針的匹配效率，這就是采用△Ct判斷基因型的理論依據(jù)。這種方法在腫瘤突變檢測(cè)也是證實(shí)可行的[7]。

用建立的MTHFR 677位點(diǎn)檢測(cè)方法，對(duì)300例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，CT型(96例，占比32%)、TT型(49例，占比16.33%)和CC型(155例，占比51.67%),與報(bào)道不一致[8]，這可能與選取樣本的隨機(jī)性有關(guān)。以Sanger測(cè)序方法為標(biāo)準(zhǔn)方法，用建立的TaqMan-MGB熒光PCR方法對(duì)該300例的檢測(cè)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果完全一致。證實(shí)了本方法的準(zhǔn)確度。

MTHFR多態(tài)性與眾多臨床疾病有相關(guān)性。MTHFR作為5，10-亞甲基四氫葉酸的代謝關(guān)鍵酶，與妊娠有著重要的相關(guān)性。有研究報(bào)道MTHFR與自然流產(chǎn)有關(guān)，C677T變突的MTHFR將使酶活性明顯下降，降低MTHFR活力，葉酸代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致合成的5-甲基四氫葉酸減少，阻礙DNA甲基化傳遞，最終由于蛋白質(zhì)及DNA甲基化不能滿足胚胎的發(fā)育需求而引發(fā)流產(chǎn)[9]。MTHFR C677T突變與非綜合性唇腭裂也有相關(guān)性[10]。張俊等[11]研究表明MTHFR C677T多態(tài)性與冠心病合并高血壓患者有關(guān)聯(lián)性[11]。T基因突變與冠脈病變程度具有相關(guān)性，攜帶T突變基因患者同型半胱氨酸水平和冠狀動(dòng)脈病變?cè)u(píng)分顯著高于CC基因型的患者。由于MTHFR C677T多態(tài)性在臨床上的應(yīng)用廣泛，眾多的檢測(cè)方法隨之出現(xiàn)。TaqMan-MGB熒光探針法可以在1個(gè)反應(yīng)管中檢測(cè)兩種基因型，具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測(cè)方法的研究重點(diǎn)在于對(duì)兩種基因型設(shè)計(jì)有足夠大的退火溫度的熒光標(biāo)記探針，以便檢測(cè)兩種基因型模版的熒光信號(hào)有足夠大的差異。同時(shí)，本研究使探針的濃度比例得到優(yōu)化，使純合型樣本FAM通道和VIC通道的檢測(cè)△Ct盡可能大，雜合型樣本FAM通道和VIC通道的檢測(cè)△Ct盡可能小。仍然存在不如人意的地方是2個(gè)檢測(cè)通道△Ct的變異系數(shù)比較大，還需進(jìn)一步改進(jìn)。

4 結(jié) 論

建立的MTHFR基因多態(tài)熒光PCR檢測(cè)方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于臨床精準(zhǔn)預(yù)測(cè)腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后及指導(dǎo)孕婦個(gè)體化補(bǔ)充葉酸。